Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen [[]]

---

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av methicillinresistenta stafylokocker

Indikation

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra bakterieisolat.

Provmaterial

Renkultur av stafylocker på agarplatta.

Analysprincip

Att extrahera bakteriernas DNA och med restriktionsenzym klyva detta till mindre fragment. DNA-fragmenten separeras efter storlek i agarosgel och ger för stammen ett unikt bandmönster.

Apparatur Termostat 37 och 55°C Centrifug ≤ 12.000 x g Pipett 1-10 µl Pipett 1-40 µl Pipett 40-200 µl Pipett 200-1000 µl Elektroforesutrustning för PFGE UV-bord med kamera Våg 300/3000 g Våg 1 mg- 160 g

Förbrukningsmateriel och reagens Ref stam NCTC 8325 McFarlandrör nr 4 13 ml polypropylenrör Engångsplatinös 1,5 ml centrifugrör Engångstippar till ovanstående pipetter Skalpell Spatlar Petriskål Gjutformar till agarospluggar Dubbeldetsillerat DNAse och RNAse fritt vatten 1M Tris HCl pH 7,5 5 M NaCl 0,5 M EDTA pH 8,0 LMT agaros (2% I EC buffert) FMC Bioproducts Lysostaphin 1 mg/ml i 0,05 M Tris HCl (pH 7,5) 0,15 M NaCl Proteinase K (5mg/ml I d.d. sterilt vatten)

TEN-buffert: 100 mM Tris HCl pH 7,5

                     100 mM EDTA
                     150 mM NaCl

EC-buffert: Trizma Hydroklorid 0,95 g

                     NaCl 58,4g 

Etylendiamintetraättiksyra 29,2 g Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter 5 g N-Lauryl-sarcosin 5 g Natriumdeoxycholat 2 g Dest vatten ca 800 ml Ph justeras med ca 50 ml 5 M NaOH till 7,5

TE-buffert: 10 mM Tris HCl pH 7,6 1mM EDTA

10x TBE buffert: Trizma base 108 g

                     Borsyra H3BO3 55,65 g
                     Titriplex III (Na-EDTA) 7,44 g
                     Dest vatten till 1000 ml

Ultra pure TM agarose Invitrogen Restriktionsenzym Sma 1 med buffert Gel Red

Analyspocedur

DNA extraktion

Över natt kultur bakterier på agarplatta slammas i 500 µl TEN-buffert till täthet 1x 109 bakt/ml i centrifugrör, centrifugeras 10 sek x 7000 x g, dekanteras och resuspenderas i 125 µl EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min.Tillsätt 125 µl 55°C 2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert. Tillsätt 12 µl 1 mg/ml lysostaphin, blanda väl genom att pipettera upp o ner några gånger och gjut agarosen i pluggformar med hjälp av pipett.Låt pluggarna stelna i +4°C 10-15 min.Placera pluggarna från respektive isolat i ett centrifugrör. Oftast gjuts två pluggar /isolat, med 1 ml EC-buffert och inkubera i 37°C.Dela en av pluggarna med skalpell i tre delar. Två av bitarna överförs till nytt rör och 250 µl TE-buffert samt 25 µl proteinase K (5 mg/ml) tillsätts. Inkubera 1 timma 55°C.Avlägsna bufferten och tillsätt ny kylskåpskall TE-buffert och detta upprepas 4-5 ggr med 10 min mellanrum. Förvara pluggarna i kyl mellan tvättarna. Pluggarna kan sparas i kyl i 4 °C någon vecka.

Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1

1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat). 2. Tillsätt 100 μl av ovanstående buffert till varje centrifugrör. 3. Tillsätt 1 μl enzym (= 1Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt. 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret. 5. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter vid 37°C. 6. De digererade pluggarana kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.

Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 ml 0,5 x TBE-buffert 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim. 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen. Om gel med 15 brunnar används placeras klyvningar från referensstammen lämpligen i brunn nr 2, 8 och 14.

4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 l vatten.) 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta. 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C. 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp. 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.