PAR 08 Mikroskopisk påvisning av mikrofilarier i blod

Huvudartikel, publicerad mars 2012. Texten är preliminär, ännu ej beslutad genom konsensusförfarande.

Till innehållsförteckngen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik

Mikroskopisk påvisning av mikrofilarier i blod

Analysprincip

Direktmikroskopi: helblod undersöks direkt för levande mikrofilarier.

Membranfiltrering: helblod filtreras genom ett filter med porstorlek 3 µm. Filtret Giemsa-färgas och undersöks i ljusmikroskop. Metoden ger ökad detektionsnivån och tillåter kvantifiering av mikrofilarier. Artbestämning kan försvaras på grund av otydlig morfologi.

Knotts koncentration: helblod blandat med 2 % formalin centrifugeras och sedimentet undersöks i ljusmikroskop efter Giemsa-färgning. Röda blodkroppar hemolyseras medan vita blodkroppar och mikrofilarier koncentreras. Metoden ökar detektionsnivån av mikrofilarier i blod och tillåter artbestämning.

Provmaterial

EDTA-blod. Blod utan tillsats av antikoagulantia kan inte användas. Rekommenderad provvolym är 2 x 5 mL; minst 3 mL blod för membranfiltrering plus 1 mL för Knotts koncentration.

Speciellutrustning

mikroskop med kalibrerat mätokular och objektiv 20x alt 25x, 40x, 100x
filterhållare
filter (3 µm porstorlek)

Analysprocedur

Direktmikroskopi

Blanda om blodet och lägg en droppe blod på objektglas och lägg på täckglas. Granska i ljusmikroskop med objektiv 10x för levande mikrofilarier. Om provet är positivt kan artbestämning göras efter färgning av tjock droppe och utstryk. Om provet är negativt eller om kvantifiering av mikrofilarier önskas fortsätt med membranfiltrering.

Membranfiltrering

OBS! Använd inte allt blod till membranfiltrering. Vid positivt fynd görs Knotts koncentration. Arbeta i dragskåp (punkt 1-8). Använd handskar.

Märk ett objektglas med provnummer.
Ta upp ett filter (3 µm porstorlek) med pincett. Blötlägg filtret i en bägare med 0,9 % NaCl tillsammans med filterhållarens vita packning. Lägg det våta filtret mitt på filterhållarens underdel. Lägg packningen ovanpå och skruva fast överdelen. OBS! Viktigt att filtret inte kommer snett!
Dra ur pistongen ur sprutan. Koppla ihop sprutan med filterhållaren. Pipettera minst 3 mL välblandat blod i sprutan. Tryck ner pistongen och spruta blodet genom filtret. Filtratet samlas upp i slaskflaskan. Lossa sprutan från filterhållaren innan pistongen dras upp.
Spruta igenom filtret 3 x 10 mL 0,9 % NaCl.
Spruta igenom 10 mL luft.OBS!

Fortsätt enligt punkterna 6-13 om filtret ska fixeras och Giemsa-färgas. För att observera levande, rörliga mikrofilarier följ beskrivningen under ”Anmärkning”.

Spruta igenom 5 mL metanol.
Spruta igenom 5 mL luft.

8. Skruva isär filterhållaren. Lägg filtret rättvänt på objektglaset, dvs. med provmaterialet uppåt. 9. Låt torka. 10. Färga 20 min med 5 % Giemsalösning i fosfatbuffert pH 7,2. För spädning av Giemsafärg se metodbeskrivning (bilaga PAR 09) 11. Skölj filtret försiktigt i en bägare med kranvatten. Håll fast filtret mot glaset med en pincett. 12. Låt torka. 13. Montera filtret med monteringsmedium och pressa försiktigt bort eventuella luftbubblor. Låt torka innan avläsning. Anmärkning Observeration av levande, rörliga mikrofilarier. 1. Skruva isär filterhållaren. Lägg filtret rättvänt på objektglaset, dvs. med provmaterialet uppåt. 2. Lägg till en droppe 0,9 % NaCl, lägg på täckglas. Granska i mikroskop med 10x och 20x objektiv. Vid positivt fynd gör Giemsa-färgning enligt följande: 3. Låt glaset torka. 4. Fixera i metanol i 3 min. 5. Färga filter med Giemsa-färg enligt punkterna 10 -13.

Avläsning Granska filtret i ljusmikroskop med objektiv 20x alternativt 25x. Använd objektiv 40x för verifiering av positiva fynd. Vid positivt fynd räknas antalet mikrofilarier. Knotts koncentration (ref. 5 och 6) Arbeta i dragskåp (punkt 1-7). Använd handskar. 1. Blanda om blodet och lägg en droppe blod på objektglas och lägg på täckglas. Granska i ljusmikroskop med objektiv 10x för levande mikrofilarier. 2. Märk minst 3 objektglas med provnummer samt datum. 3. Blanda 9 mL 2 % formalin med 1 mL blod i ett 10 mL-rör. 4. Centrifugera 500 x g i 10 minuter. 5. För över supernatanten till slaskflaskan med en plastpipett. Sedimentet består av vita blodkroppar och mikrofilarier (om de är närvarande). 6. Mät volymen av sedimentet med en pipett så att koncentrationen av mikrofilarier kan beräknas. 7. Pipettera sedan flera 50 µL droppar av sedimentet på varje objektglas tills sedimentet tar slut. OBS! Använd allt sediment. Låt glasen lufttorka i minst 60 minuter och fixera sedan materialet 30 sekunder i 99,8 % metanol innan Giemsafärgning. 8. Färga preparaten 20 min med 5 % Giemsalösning i fosfatbuffert pH 7,2. För spädning av Giemsa se metodbeskrivning (bilaga PAR 09) Avläsning Granska preparaten i ljusmikroskop med objektiv 20x. Använd objektiv 40x och 100x för verifiering. För färgbarhet, storlek och övriga karakteristika av mikrofilarier se referenser 2 och 3. Räkna antal mikrofilarier i sedimentet. Kvalitetssäkring: Intern För bildmaterial se referenser 2 och 3. Intern panel med sparade positiva preparat samt preparat från UK-NEQAS. Extern Mikrofilarier ingår i UK-NEQAS-blodutskick.

Kommentar Membranfiltrering och Knotts koncentration: Sensitiviteten är hög jämfört med tjock droppe/utstryk. Enstaka mikrofilarier per mL helblod kan detekteras. Specificiteten är 100 %. Mikrofilarier är inte rörliga med Knotts koncentration eftersom 2 % formalin dödar dem. Svarsrutiner Mikrofilaria påvisade (ange genus och art). Mikrofilaria inte påvisade. Säkerhet och miljöaspekter Se malariamikroskopi (PAR 09) Referenser 1. Dennis DT, Kean BH. Isolation of microfilariae. Report of a new method. J Parasitol. 1971, 57:1146-47. 2. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago. 3. WHO. Bench Aids for the Diagnosis of Filarial infections. 4. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. American Society for Microbiology Press, Washington D.C. 5. http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Filariasis.htm 6. Markell EK, Voge M. Medical Parasitology. 5:e ed, WB Saunders Company, Philadelphia, 1981.