Bilaga 6. Parasitologiska metoder

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

Bilaga 6 A.

Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces

Se länk PAR 01

Bilaga 6 B.

Mikroskopisk påvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isosporaoocystor efter färgning med modifierad Ziehl-Neelsen

Se länk PAR 02

Bilaga 6 C.

Analysprincip/provmaterial

Cytokemisk färgningsmetod speciellt lämpad för påvisning av trofozoiter. Även cystor kan påvisas med denna metod. Feces eller annat provmaterial fixeras i SAF (sodium acetate-acetic acid formalin) fixativ i omedelbar anslutning till provtagningen. Parasiterna infärgas i olika röda och blågröna nyanser mot en grön bakgrund. Avläsning sker i ljusmikroskop.

• Apparatur
  • centrifug
  • dragskåp
  • ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
  • samt immersionsobjektiv 50x och 100x

• Material
  • träpinnar
  • gasväv
  • engångsplastmuggar
  • centrifugrör med skruvlock, 10 mL plast
  • plastpasteurpipett
  • objektglas med mattfält
  • glaskyvetter med lock
  • täckglas
  • avfallsburk

• Reagens
  • SAF-fixativ. Sodium acetate-acetic acid formalin (Meridian Diagnostics, art nr 900212: färdiga provtagningsrör). Kan även köpas separat, art nr 11-9007.

Ovanstående fixativ består av följande ingredienser:

• • Ättikssyra (isättika) 100 % 2 %
  • Formaldehyd 1,6 %
  • Natriumacetat 0,9 %
  • Metanol 0,4 %
  • Ytspänningsnedsättande ämne 0,1 %
  • Avjoniserat vatten

• • • Natriumklorid 0,9 %
  • Albuminlösning, Mayer´s albumin, Meridian (medföljer SAF-fixativrör Meridian , art nr 900212)
  • Etanol 70 %
• • Trikromfärg

Trichrome stain (Meridian Diagnostics art nr 400101)

Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:Chromotrope 2R 6 g

• Light green SR 1,5 g
• Fast green FC 1,5 g
• Fosforwolfram syra 7 g
• Isättika 10,5 g
• Destillerat vatten 1000 mL

• Ättiksyra i etanol 90 %

Avfärgningslösning för trikromfärgning

• Ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
• Etanol 90 % 995,5 mL

• Etanol 95 %
• Etanol 99,5 %
• Histoclear

Apelsinolja, d-limonen, C10H16, 70-100 % National Diagnostics HS-200

• DPX mounting medium
• Immersionsolja för ljusmikroskopi

Analysprocedur

Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring.

• 1. Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ. Fyll med feces till markeringen på provtagningsröret. Blanda feces och vätska ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prov som insänts i SAF-fixativ blandas ånyo; rör om med träpinnar.
• 2. Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsplastmugg.
• 3. Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen i ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
• 4. Centrifugera 1 min i 800 x g .
• 5. Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
• 6. Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
• 7. Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10 - 20 min).

Fixering och färgningsprocedur. Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett.

• 1. Fixera glaset 30 min i 70 % etanol.
• 2. Låt stå i trikromfärg 6 - 8 min. Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk.
• 3. Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol).Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen bör¬jar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt.
• 4. Skölj 2 gånger i 95 % etanol.
• 5. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
• 6. Låt stå i 99,5 % etanol 3 min.
• 7. Låt stå i Histoclear 3 min.
• 8. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka i dragskåp.

Avläsning av preparat

Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt.

Kvalitetssäkring

Positiv kontroll: Fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade Dientamoeba fragilis-trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp.

Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3.

Anmärkningar

Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av Dientamoeba fragilis då denna parasit saknar cystform.

Referenser

• 1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain.
• 2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa.
• 3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.

Bilaga 6 D.

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer efter förstärkt trikromfärgning

Analysprincip

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer. Lufttorkade preparat fixeras med metanol, infärgas med modifierad trikromfärg, avfärgas och dehydreras. Avläsning sker i ljusmikroskop. Sporerna färgas rosa mot en blå bakgrund.

• Apparatur
  • centrifug
  • dragskåp
  • automatpipett 10 - 50 µL
  • ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
  • immersionsobjektiv 100x

• Material
  • objektglas med mattfält
  • pipettspetsar 10 - 50 µL
  • glaskyvetter med lock
  • täckglas No 0.

• Reagenser
  • Formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin. En del koncentrerad formaldehyd (37 - 40 %) späds med 9 delar destillerat vatten.
  • Metanol 99 %
  • Förstärkt trikromfärg (Trichrome Blue, Meridian 400501)

Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:

• Chromotrope 2R 60,0 g
• Aniline Blue 5,0 g
  • Fosforwolframsyra 2,5 g
  • Isättika 30 mL
  • Destillerat vatten 1000 mL

• • Ättiksyra i etanol 90 %
  • Ättiksyra (isättika) 100 % 4,5 mL
  • Etanol 90 % 995,5 mL
  • Etanol 95%,
  • Etanol 99, 5 %
  • Histoclear

Apelsinolja, d-limonen, C10H16 70-100 % National Diagnostics HS-200

• DPX mounting medium BDH 36029 4H
• Immersionsolja

Analysprocedur

Förbehandling av provmaterial

Feces: okoncentrerad feces fixeras i formaldehyd eller SAF.

Lämplig spädning: 1 del feces till 3 delar fixativ. Mycket tunn fecesblandning centrifugeras och sedimentet används för utstryk. För att höja känsligheten färgas även ett koncentrerat fecesprov – späd sedimentet till lämplig tjocklek.

• Färgningsprocedur
  • 1. Märk önskat antal objektglas. Glöm ej att ta med positiv kontroll.
  • 2. Stryk med pipettspetsen ut ca 10 µL av provmaterialet. Gör mycket tunna utstryk.
  • 3. Låt preparatet lufttorka.
  • 4. Fixera glaset 5 min i metanol.
  • 5. Placera glaset i trikromfärg. Låt stå 90 min i rumstemperatur.
  • 6. Torka av färgöverskottet på glasets baksida mot en allduk. Tryck försiktigt glasets framsida mot allduken.
  • 7. Avfärga i avfärgningslösning (ättikssyra i 90 % etanol) ungefär 5 sek. Låt överskott av vätska rinna av mot allduk mellan varje kyvett.
  • 8. Skölj hastigt i 95 % etanol.
  • 9. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
  • 10. Låt stå i 99,5 % etanol 10 min.
  • 11. Låt stå i Histoclear 10 min.
  • 12. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka. Förvara glasen skyddade mot ljus.

Granskning av preparat

Granska 200 synfält med 100x immersionsobjektiv. För morfologiska kriterier hänvisas till avsnittet om microsporidia i denna bok.

Kvalitetssäkring

Positiv kontroll som innehåller formaldehydfixerade microsporidiasporer. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prov. Lämpligt bildmaterial finns under referens 3 och 4.

Referenser

• 1. Ryan NJ, Sutherland G, Coughlan K, Globan M, Doultree, Marshall J, Baird, Pedersen J, Dwyer B. A new trichromeblue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. 1993;31:3264-3269.
• 2. Meridian Diagnostics, Inc. Para-PacTrichrome Blue. Produktinformation.
• 3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
• 4. Rondamelli EG, Scaglia M. Atlas of human protozoa. Masson 1993.