Genotypisk MRSA-verifiering
Artikel publicerad april 2012. Innehåll preliminärt i väntan på konsensusförfarande
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar
och
förgreningssidan MRSA
Genotypisk MRSA-verifiering med LightCycler
Indikation
Verifiering av meticillinresistens hos S aureus genom att påvisa mecA-gen och nuc-gen.
MecA-genen kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sänkt affinitet för b-laktamantibiotika,.vilket gör olika arter av mecA-bärande stafylokocker resistenta mot alla b-laktam-antibiotika inkluderande batalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. Särskilt allvarligt är meticillinresistens hos S. aureus, eftersom antibiotika ur denna grupp sedan länge utgjort standardterapi vid infektioner med sådana bakterier. MecA-genen sitter på en mobil kasettkromosom och är därmed benägen att sprida sig.
Metoden är utformad för att påvisa förekomst av mecA-gen hos stafylokocker genom PCR-amplifiering av målområdet och detektion med SYBR Green med realtids-PCR-instrument. I kombination med påvisande av nuc-gen utförd med samma DNA-preparation är den avsedd för verifiering av fynd av MRSA. Primrar för mecA-amplifiering påvisar också en variant av mecA-genen som påvisats i bl.a. stammen LGA251 (1, 2)
Material
Utgångsmaterialet är renstrukna kolonier på blodagar av misstänkta bakterier. För amplifiering används PCR-instrument LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) och reagenser LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics).
Referensstammar: CCUG 35603 S. aureus som kontroll mecA+
CCUG 17621 S. aureus som kontroll mecA-
LGA251 S. aureus som kontroll mecAM10/0061
PCR primer MEC9 5´- TCACCAGGTTCAAC[Y]CAAAA (1)
PCR primer MEC10 5´- CCTGAATC[W]GCTAATAATATTTC (1)
PCR primer NUC4 5’-TCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC (3)
PCR primer NUC5 5’-GAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCT TC (3)
Analys
DNA-frisättning
Slamma en liten koloni eller motsvarande mängd bakterier i 100 µl sterilt avjoniserat vatten i ett sterilt 1.5 mL eppendorfrör. Se till att bakterien blir ordentligt uppslammad i vattnet genom att snurra platinösen och därefter resuspendera suspensionen. Mängden bakterier är lagom för analys när man kan ana en lätt grumlighet
PCR
Varje isolat analyseras i två separata 20 µL PCR-reaktioner, en för detektion av nuc och en för mecA. PCR-reaktionerna innehåller PCR-reagens enligt tillverkarens rekommendation, 0.5 µM av respektive primrar (NUC4/NUC5 respektive MEC9/MEC10) och 2 µL templat (suspension av bakterie).
Följande amplifieringsprofil används:
Program Temp.ºC Tid mm:ss Hastighet ºC/s Acquisition Mode Fast start 95 10:00 20 PCR 3-step 95 00:10 20 none 35 cycler 50 00:05 20 none 72 00:12 20 singel Smältkurva 95 00:10 20 none 50 00:30 20 none 90 00:00 0,1 continuous Cooling 40 00:30 20 none
Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från NUC respektive mecA amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat. Förväntade Tm för mecA PCR-produkt är runt 78.6°C, för mecA LGA251 runt 80.0°C och för NUC runt 79.2°C.
Referenser
1. Laura García-Álvarez et al. Meticillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark: a descriptive study. Lancet Infect Dis 2011;11: 595–603
2 Shore AC et al. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Aug;55(8):3765-73. Epub 2011 Jun 2
3 Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad. Egen design.