Bilaga 6. Parasitologiska metoder

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

Bilaga 6 A.

Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces

Analysprincip: Formalinfixerad feces filtreras, skakas med etylacetat och centrifugeras för att separera maskägg, larver, cystor och oocystor från fett och skräp. Efter centrifugering bildas fyra skikt: i botten av röret ett se¬diment, sedan en formalinfas, en fettplugg med skräp och överst en etylacetatfas. Sedimentet granskas i ljus¬mikroskop. Materialet i sedimentet kan även användas till olika specialfärgningar för att identifiera specifika parasiter. Metoden är ej lämplig för påvisning av trofozoiter i feces.

Apparatur

• dragskåp
• centrifug
• (skakapparat)
• ljusmikroskop med kalibrerat mätokular

objektiv 10x, 25x, 40x

Material

• träpinnar med och utan bomull
• gasväv
• engångsmuggar av plast
• graderade koniska centrifugrör av plast med tillhörande lock (OBS! plasten måste tåla etylacetat)
• provrörsställ
• pipett 5 eller 10 mL
• pipettfyllare
• objektglas med mattfält
• täckglas
• avfallsburk

• Reagenser
  • Formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin)
  • Etylacetat

C4H8O2 p.a. Märkning: brandfarligt, hälsovådligt.

• Förvaring
  • dragskåp eller ventilerat kemikalieskåp.
  • d´Antonis jodlösning
  • Lös 1,0 g kaliumjodid och 1,5 g jodkristaller i 100 mL destillerat vatten. Använd magnetomrörare. En del kristaller förblir olösta. Förvaras i mörk flaska.
  • Hållbar ett år.
  • Natriumklorid 0,9 %

Analysprocedur

• 1. Blanda en sked (ca 1 gram) feces med ca 7 mL 3,7 % formaldehyd i ett märkt rör. (Observera att detta moment redan är utfört på de prov som sänts in i formaldehyd eller SAF-fixativ). Blanda provet noggrant med ett par träpinnar.
• 2. Låt stå 30 min för fixering och inaktivering.
• 3. En lagom mängd fecesblandning (beroende på provets tjocklek) filtreras genom ett lager fuktad gasväv lagt över en plastbägare. OBS! Om provet är mycket tunt eller mest består av slem fortsätt direkt till punkt 7 (se kommentar 1).
• 4. Kontrollera om det finns maskar eller maskdelar i gasväven.
• 5. Häll över filtratet i ett märkt centrifugrör. Justera volymen med formalin till ca 7 mL. Se kommentar 2 om provet fixerats i SAF-fixativ.
• 6. Tillsätt 3 mL etylacetat och sätt på skruvlocket. Skaka med skakapparat 15 sek eller 30 sek för hand.

• 7. Centrifugera i minst 1 000 x g under 1 - 2 min. Behåll skruvlocket på. Centri¬fugera 5 min om Cryptosporidium undersökning är begärd (se kommentar 3).
• 8. Röret innehåller nu fyra skikt. I botten ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg och överst en etylacetatfas.
• 9. Lossa försiktigt fettpluggen med en träpinne och häll av allt utom sedimen¬tet (som bör vara ganska litet, se kommentar 4). Häll avfallet i lämpligt kärl.
• 10. Torka av insidan av röret med en bomullspinne.
• 11. Sätt vid behov till ett par droppar 0,9 % NaCl till bottensatsen.
• 12. Låt röret stå och dunsta av i dragskåp innan avläsning.

Kommentarer

• 1. Mycket tunna och/eller slemmiga prov tappar det mesta av sitt material vid ovanstående koncentrationsförfarande. Sådana prov centrifugeras direkt efter formalinfixering utan vare sig filtrering eller skakning med etylacetat.

• 2. Om provet sänts in i SAF-fixativ centrifugeras först filtratet enligt punkt 7 ovan. Supernatanten hälls av och 7 mL formalin tillsätts.

• 3. Föreslagna centrifugeringstider och g-tal varierar mycket mellan olika publikationer. För koncentration av Cryptosporidium-oocystor rekom¬menderas längre centrifugeringstid (5 - 10 min) än för cystor och mask¬ägg (1 - 2 min).

• 4. Om bottensatsen är för tjock har man antagligen tagit för mycket feces¬blandning under punkt 3 ovan.

Avläsning

Blanda sedimentet. Märk ett objektglas med provnummer och lägg upp två preparat från varje prov. Om frågeställningen avser trematodägg granskas hela sedimentet. Det ena preparatet blandas med en droppe d´Antonis jodlösning innan täckglas läggs på.

Granska systematiskt hela det ofärgade preparatet med 10x objektiv eller med högre förstoring om så behövs. Det jodfärgade preparatet granskas med 25x objektiv eller högre.

Maskägg syns i regel bra med 10x objektiv och utan jodfärgning, medan cystor lättare upptäcks och identifieras vid högre förstoring och med jodfärgning. An¬vänd mätokular när så erfordras.

Cryptosporidium-oocystor kan ibland upptäckas vid direktmikroskopi av sedi¬ment från koncentrationsmetoden. För konfirmering erfordras dock färgning med specifik metod. Se metodbeskrivning Ziehl-Neelsen färgning (Bilaga 6.2).

För morfologiska kriterier hänvisas till respektive parasitavsnitt.

Kvalitetssäkring

Intern Koncentrationsförfarandet kontrolleras årligen genom att antalet cystor/maskägg i prov med känt innehåll räknas före och efter koncentrering. För lämpligt bild¬material se referens 4 och 5.

Extern

UK-NEQAS fecesutskick.

Anmärkningar

• Tillsatts av Triton X till feces uppges ge ökat utbyte av maskägg.
• Metallsil med maskstorlek 425 µm kan användas som alternativ till fuktad gasväv för att filtrera prov.

Referenser

• 1. Allen A V H, Ridley D D. Further observations on the formolether concentration technique for faecal 0parasites. J Clin Path 1970;23:545-546.
• 2. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
• 3. NEQAS informationsblad: Formolether concentration method for ova and cysts
• 4. Young K H, Bullock S L, Melvin D M, Sprull C L. Ethyl acetate as a substitute for diethyl ether in the Formalin-ether sedimentation technique. J Clin Microbiol 1979;10:852-853.
• 5. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 1-9

Bilaga 6 B.

Mikroskopisk påvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isosporaoocystor efter färgning med modifierad Ziehl-Neelsen

Analysprincip

Mikroskopisk påvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut på objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol och bakgrundsfärgas med malakitgrönt. Oocystorna färgas röda mot en grön bakgrund.

• Apparatur
  • dragskåp
  • automatpipett 10 - 50 µL
  • ljusmikroskop med objektiv 40x,
  • mmersionsobjektiv (50x) 100x
  • kalibrerat mätokular

• Material
  • objektglas med mattfält
  • pipettspetsar 10 - 50 µL
  • glaskyvett/färgställ
  • pasteurpipetter plast
  • avfallsburk
  • täckglas *Reagens
  • Metanol 99,8 % CH3OH p.a. Merck 1.06009
  • Karbolfuchsinlösning

• • Färdigberedd Karbolfuchsinlösning Tb color

Merck 1.08512.0500

Alternativ II

• Karbolfuchsinlösning (Referens 1)
• Basiskt fuchsin 10 g
• Etanol 99,5 % 100 ml
• Fenol 50 g
• Destillerat vatten 1000 mL

Lös 10 g basiskt fuchsin i 100 mL etanol. Använd en flaska som rymmer minst 1 500 mL. Väg upp 50 g fenol i en bägare och lös det i en del av vattnet. Blanda alltsammans i flaskan. Sätt till resten av vattnet och blanda ånyo. Märk flaskan enligt ovanstående rubrik.

• Saltsyra i etanol

Avfärgningslösning för Ziehl-Neelsen Blanda 10 mL konc HCl med 1990 mL 95 % etanol. • Malakitgrönt 1 % Lös 1 g malakitgrönt i 100 mL destillerat vatten. • DPX mounting medium • Positiv kontroll Ziehl-Neelsen färgning Formalinfixerat fecesprov med Cryptosporidium-oocystor • Immersionsolja för ljusmikroskop

• Analysprocedur

Förbehandling av provmaterial

För att höja känsligheten rekommenderas att färgningen utförs på både koncentrerat och okoncentrerat feces. Fecesprover som innehåller rikligt med slem kan nämligen förlora parasiter vid koncentrering. För koncentrering av feces se metodbeskrivning Bilaga 6.1.

• Färgningsprocedur

• • 1. Märk objektglasets mattfält med labnummer. Positiv kontroll skall ingå i varje färgningsomgång.
  • 2. Stryk med pipettspetsen ut ca 20 µL av provmaterialet på objekt-glaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter.
  • 3. Låt preparatet lufttorka i minst 60 min.
  • 4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock.
  • 5. Lägg glaset på färgstället och täck med karbolfuchsin. Använd plast¬pasteur¬pipett. Färga 20 min.
  • 6. Skölj med rikligt rinnande kranvatten.
  • 7. Avfärga ett glas i taget med avfärgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda färgen är borta.
  • 8. Skölj med rikligt rinnande kranvatten.
  • 9. Täck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min.
  • 10. Skölj med rikligt rinnande kranvatten.
  • 11. Låt preparatet torka.
  • 12. Montera med DPX och täckglas.
  • 13. Låt preparatet torka.

Avläsning

Granska hela preparatet. Använd 40x eller 50x objektiv för översikts-granskning och 100x immersionsobjektiv för verifiering. Mät storleken på eventuella oocystor med mätokular. För morfologiska kriterier av olika oocystor se under respektive parasitavsnitt.

Kvalitetssäkring

• Internkontroll
  • Positiv kontroll: Fecesprov med känt innehåll av formaldehydfixerade Cryptosporidiumoocystor. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prover.

• • För bildmaterial se referens 4.

Externkontroll

UK-NEQAS fecesutskick

Säkerhetsaspekter

Iakttag försiktighet vid arbete med ej avdödat provmaterial. 3,7 % formaldehyd under 30 min avdödar Cryptosporidium-oocystor.

Referenser

• 1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987;216-218.
• 2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995;96-97.
• 3. NEQAS Teaching sheet nr 932. Cryptosporidium, Isospora belli and Cyclospora.
• 4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora.

Bilaga 6 C.

Analysprincip/provmaterial

Cytokemisk färgningsmetod speciellt lämpad för påvisning av trofozoiter. Även cystor kan påvisas med denna metod. Feces eller annat provmaterial fixeras i SAF (sodium acetate-acetic acid formalin) fixativ i omedelbar anslutning till provtagningen. Parasiterna infärgas i olika röda och blågröna nyanser mot en grön bakgrund. Avläsning sker i ljusmikroskop.

• Apparatur
  • centrifug
  • dragskåp
  • ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
  • samt immersionsobjektiv 50x och 100x

• Material
  • träpinnar
  • gasväv
  • engångsplastmuggar
  • centrifugrör med skruvlock, 10 mL plast
  • plastpasteurpipett
  • objektglas med mattfält
  • glaskyvetter med lock
  • täckglas
  • avfallsburk

• Reagens
  • SAF-fixativ. Sodium acetate-acetic acid formalin (Meridian Diagnostics, art nr 900212: färdiga provtagningsrör). Kan även köpas separat, art nr 11-9007.

Ovanstående fixativ består av följande ingredienser:

• • Ättikssyra (isättika) 100 % 2 %
  • Formaldehyd 1,6 %
  • Natriumacetat 0,9 %
  • Metanol 0,4 %
  • Ytspänningsnedsättande ämne 0,1 %
  • Avjoniserat vatten

• • • Natriumklorid 0,9 %
  • Albuminlösning

Mayer´s albumin, Meridian (medföljer SAF-fixativrör Meridian , art nr 900212)

• • Etanol 70 %
• • Trikromfärg

Trichrome stain (Meridian Diagnostics art nr 400101)

Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:Chromotrope 2R 6 g

• Light green SR 1,5 g
• Fast green FC 1,5 g
• Fosforwolfram syra 7 g
• Isättika 10,5 g
• Destillerat vatten 1000 mL

• Ättiksyra i etanol 90 %

Avfärgningslösning för trikromfärgning

• Ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
• Etanol 90 % 995,5 mL

• Etanol 95 %
• Etanol 99,5 %
• Histoclear

Apelsinolja, d-limonen, C10H16, 70-100 % National Diagnostics HS-200

• DPX mounting medium
• Immersionsolja för ljusmikroskopi

Analysprocedur

Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring.

• 1. Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ. Fyll med feces till markeringen på provtagningsröret. Blanda feces och vätska ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prov som insänts i SAF-fixativ blandas ånyo; rör om med träpinnar.
• 2. Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsplastmugg.
• 3. Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen i ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
• 4. Centrifugera 1 min i 800 x g .
• 5. Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
• 6. Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
• 7. Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10 - 20 min).

Fixering och färgningsprocedur. Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett.

• 1. Fixera glaset 30 min i 70 % etanol.
• 2. Låt stå i trikromfärg 6 - 8 min. Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk.
• 3. Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol).

Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen bör¬jar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt.

• 4. Skölj 2 gånger i 95 % etanol.
• 5. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
• 6. Låt stå i 99,5 % etanol 3 min.
• 7. Låt stå i Histoclear 3 min.
• 8. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka i dragskåp.

Avläsning av preparat

Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt.

Kvalitetssäkring

Positiv kontroll: Fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade Dientamoeba fragilis-trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp.

Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3.

Anmärkningar

Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av Dientamoeba fragilis då denna parasit saknar cystform.

Referenser

• 1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain.
• 2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa.
• 3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.

Bilaga 6 D.

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer efter förstärkt trikromfärgning

Analysprincip

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer. Lufttorkade preparat fixeras med metanol, infärgas med modifierad trikromfärg, avfärgas och dehydreras. Avläsning sker i ljusmikroskop. Sporerna färgas rosa mot en blå bakgrund.

• Apparatur
  • centrifug
  • dragskåp
  • automatpipett 10 - 50 µL
  • ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
  • immersionsobjektiv 100x

• Material
  • objektglas med mattfält
  • pipettspetsar 10 - 50 µL
  • glaskyvetter med lock
  • täckglas No 0.

• Reagenser
  • Formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin. En del koncentrerad formaldehyd (37 - 40 %) späds med 9 delar destillerat vatten.
  • Metanol 99 %
  • Förstärkt trikromfärg (Trichrome Blue, Meridian 400501)

Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:

• Chromotrope 2R 60,0 g
• Aniline Blue 5,0 g
  • Fosforwolframsyra 2,5 g
  • Isättika 30 mL
  • Destillerat vatten 1000 mL

• • Ättiksyra i etanol 90 %
  • Ättiksyra (isättika) 100 % 4,5 mL
  • Etanol 90 % 995,5 mL
  • Etanol 95%,
  • Etanol 99, 5 %
  • Histoclear

Apelsinolja, d-limonen, C10H16 70-100 % National Diagnostics HS-200

• DPX mounting medium BDH 36029 4H
• Immersionsolja

Analysprocedur

Förbehandling av provmaterial

Feces: okoncentrerad feces fixeras i formaldehyd eller SAF.

Lämplig spädning: 1 del feces till 3 delar fixativ. Mycket tunn fecesblandning centrifugeras och sedimentet används för utstryk. För att höja känsligheten färgas även ett koncentrerat fecesprov – späd sedimentet till lämplig tjocklek.

• Färgningsprocedur
  • 1. Märk önskat antal objektglas. Glöm ej att ta med positiv kontroll.
  • 2. Stryk med pipettspetsen ut ca 10 µL av provmaterialet. Gör mycket tunna utstryk.
  • 3. Låt preparatet lufttorka.
  • 4. Fixera glaset 5 min i metanol.
  • 5. Placera glaset i trikromfärg. Låt stå 90 min i rumstemperatur.
  • 6. Torka av färgöverskottet på glasets baksida mot en allduk. Tryck försiktigt glasets framsida mot allduken.
  • 7. Avfärga i avfärgningslösning (ättikssyra i 90 % etanol) ungefär 5 sek. Låt överskott av vätska rinna av mot allduk mellan varje kyvett.
  • 8. Skölj hastigt i 95 % etanol.
  • 9. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
  • 10. Låt stå i 99,5 % etanol 10 min.
  • 11. Låt stå i Histoclear 10 min.
  • 12. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka. Förvara glasen skyddade mot ljus.

Granskning av preparat

Granska 200 synfält med 100x immersionsobjektiv. För morfologiska kriterier hänvisas till avsnittet om microsporidia i denna bok.

Kvalitetssäkring

Positiv kontroll som innehåller formaldehydfixerade microsporidiasporer. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prov. Lämpligt bildmaterial finns under referens 3 och 4.

Referenser

• 1. Ryan NJ, Sutherland G, Coughlan K, Globan M, Doultree, Marshall J, Baird, Pedersen J, Dwyer B. A new trichromeblue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. 1993;31:3264-3269.
• 2. Meridian Diagnostics, Inc. Para-PacTrichrome Blue. Produktinfor¬mation.
• 3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
• 4. Rondamelli EG, Scaglia M. Atlas of human protozoa. Masson 1993.