Bilaga 8 (CNS)
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet
Bilaga 8
Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k enligt metod från Sahlgrenska sjukhuset, Göteborg, modifierad vid Smittskyddsinstitutet
Provtagningsmaterial
Cerebrospinalvätska (Csv)
Förvaras vid 4 °C eller -20 °C fram till transporten
Transport vid rumstemperatur
Apparatur
PCR-apparat (TC- 1, Perkin Elmer)
Varjabla pipetter, fördelade på arbetsstationer
Elektroforesutrustning
Polaroidkamera
UV-ljusbord
Förbrukningsmaterial
0,5 mL PCR-rör
1,5 mL Eppendorfrör
0,5-10 μL tippar utan filter
0,5-10 μL tippar med filter
10-200 μL tippar utan filter
100-1000 μL tippar utan filter
Reagens
H20: Sterilt vatten (dest.vatten) av hög renhetsgrad
Olja: Mineralolja, light
Primers: Pharmacia Biotech
Förvaras i -20 °C i Rena rummet
Koncentrationer:
1,4 μmol/L: CMVI och CMV2
2,8 μmol/L: CMV3 och CMV4
Samtliga primers är lokaliserade inom fjärde exonet av Major Immediate early gene (UL 122-123)
1:a amplifieringen
- CMV1 5’-GCG CCG CAT TGA GGA GAT CTG CAT-3’
- CMV2 5’-GAG CAC CCT CCT CCT crr CCT CAT-3’
Storlek på PCR-fragment: 299 baspar
2:a amplifieringen
- CMV3 5’-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3
- CMV4 5-CAG CCA CAA TI’A CTG AGG ACA GAG-3
Storlek på PCR-fragment: 191 baspar
10 x PCR buffert II, Perkin Elmer
Förvaras vid 4 °C.
MgCl2, Perkin Elmer
Koncentration: 15 mmol/L,
Förvaras vid 4 °C.
dNTP, Pharmacia Biotech
Koncentration: 2 mmol/L används i en blandning av samtliga nukleotider.
Förvaras vid -20 °C.
Enzym, Perkin Elmer
Taq polymeras 5 U/μL
Förvaras vid -20 °C.
Agaros NA, Pharmacia Biotech
Förvaras som pulver i rumstemperatur.
10x TBE-buffert, Karolinska sjukhuset (KS)
pH 8,0-8,4. Späds i HO till lx TBE-buffert.
Förvaras i rumstemperatur.
Etidiumbromid (EtBr) KS
Koncentration: 10 mg/mL.
Förvaras i rumstemperatur.
6x Loading buffert, Scandinavian Diagnostic Services (SDS)
Blue orange loading buffert.
Förvaras vid 4 °C.
Provberedning inför 1:a amplifieringen
- Frys likvor vid <-18 °C.
- Tina i rumstemperatur.
- Sätt 10 μL likvor till 0,5 mL PCR-rör i duplikat.
- Tillsätt 1 droppe (-.25 μL) mineralolja. Stäng locket ordentligt.
- Hetta upp likvorprovt i PCR-rören med olja i PCR-maskinen 95 °Ci—10 min.
- De olika momenten i proceduren utförs på fyra separata arbetsstationer för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.
- Skriv analysprotokoll där 1:a röret är en vattenkontroll och patientprov analyseras i duplikat. Vattenkontroller sätts mellan olika patientduplikat. Positiva kontroller sättes sist.
- Förbehandla likvor enil. provbehandling ovan (sättningsbox).
- Plocka fram reagenserna (ren plats) och blanda mastermix 1 i Eppendorfrör 1,5 mL.
- Sätt upp PCR-rör i still (sättningsbox) inklusive de förbehandlade , provrören enligt analysprotokoll.
- Stäng rören och märk locken med nummer enligt analysprotokoll Oppna ett rör i taget i nummerordning.
- Tillsätt 10 μL H20 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpå
- Tillsätt 40 μL mastermix/rör under oljan.
- Stäng rören ordentligt.
- Sätt de positiva kontrollerna sist. Eventuella uppspädning& av positiva kontroller görs efter det att proven är satta och locken ordentligt tillsiutna.
1:a amp1ifieringen
Kör följande program:
5 min 92 °C
(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C I min)x20 cykler
1 min72°C
sök 4 °C
Provberedning inför 2:a amplifieringen
- Gör MastermiX 2 med inre primers (ren plats).
- Sätt upp PCR-rör i ställ.
- Fördela 47,5 μL mastermix/rör
- Tillsätt 1 droppe olja ovanpå.
- Stäng locken och märk locken med nummer enl. analysprotokoll.
- Tag med rören till nestningsplats.
- För över 2,5 μL prov från 1:a steget till de nya rören.
Stor risk för kontamination, öppna därför ett rör i taget.
2:a amplifieringen
Kör följande program:
5 min 92 °C
(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C 30Sek)X30 cykler
1 min 72 °C
Sök 4 °C
Elfores
- Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 μg EtBr/mlL agaros i lx TBEbuffert. Gjut en gelform med kammar. Lägg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 μg EtBr/mL TBEbuffert.
- På en remsa parafihIl droppas 2 μL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 μL PCRprodukt. Sätt 10 μL produkt/hål i gelen.
- Starta aggregatet (140 V).
- Låt gelen gå i ca 20-30 min.
- Stäng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den på UV-bordet Ta ett kort till analysprotokoflet
Bedömning
- Analysen godkänns om 5 och/eller 10 fg av renat CMV DNA kan detekteras.
- Kontrollera storleken av amplifikat jämfört med den positiva kontrollen.
- Om bägge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsajcad CNS-jnfektjon
- Om endast ena portionen blir positiv sätts provet om. Om fyndet kan repeteras svaras provet ut positivt, annars negativt.
- Om oklarheter: Sätt om provet, ev i spädning eller efter DNA-extration om det ger smear.