Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

EJ REDIGERAD

PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI)

Analysprincip/teststrategi

Prov utodlas på medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utväxta bakterierna i primärstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

Tabell 31.

  • Målgen Bakterietyp Amplimer
  • stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
  • stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
  • eae EHEC/EPEC 376 (bp)
  • ial EIEC/Shigella 320 (bp)
  • bfpA EPEC 367 (bp)
  • eltB ETEC 322 (bp)
  • estA ETEC 147 (bp)


Reagens Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1. Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer. dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.




Tabell 32.

Målgen Primer Primersekvens

eltB LT 1 5'TCT CTA TGT GCA TAC GGA GC3' eltB LT r 5'CCA TAC TGA TTG CCG CAA T3' estA STI2 1 5'GCT AAA CCA GTA GAGG TCT TCA AAA3' estA STI2 r 5'CCC GGT ACA GAGC AGG ATT ACA ACA3' stx1 VT1 l 5'GAA GAG TCC GTG GGA TTA CG3' stx1 VT1 r 5'AGC GAT GCA GCT ATT AAT AA3' stx2 VT2 l 5'ACC GTT TTT CAG ATT TTGA CAC ATA3' stx2 VT2 r 5'TAC ACA GGA GCA GTT TCA GAC AGT3' eae eae u 5'CAC ACG AAT AAA CTG ACT AAA ATG3' eae eae 1 5'AAA AAC GCT GAC CCG CAC CTA AAT3' ial SHIG 1 5'CTG GTA GGT ATG GTG AGG3' ial SHIG 2 5'CCA GGC CAA CAA TTA TTT CC3' bfp A bfpA2 u 5'TTC TTG GTG CTT GCG TGT CTT TT3' bfp A bfpA2 1 5'TTT TGT TTG TTG TAT CTT TGT AA3'

GA= en blandning av lika delar dGTP och dATP i samma position. I EHEC-PCR ingår två primermixar, Stx1+2- och eae-mix. I EPEC-PCR ingår också två primermixar, bfpA2- och eae-mix .

Analysprocedur Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (ca. 109-5x109 bakterier/ml). Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS. Koka röret i 20 minuter. Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100°C. Pelletera cellresterna.




PCR: Mix / PCR-rör antal µL GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0 dNTP 1,25mmol/L 1,6 MgCl2 25mmol/L 1,2 Primer av varje 2,5µmol/L 0,4 Taq 5U/µL 0,1 sterilt H2O upp till 18,0 µL

Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.

PCR-program:

4 min 96°C

20 sek 94°C 20 sek 55°C 30 cykler 10 sek 72°C

7 min 72°C

Post-PCR 10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosg¬el-elektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 mi-nu¬ter. Om stx1eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaros-halten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

Referenser Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas stx1 X07865 stx2 X07865 eae X60439 bfpA Z12295 

 eltB	Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
estA	Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
 ial	Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Bilaga_3._PCR-diagnostik_av_diarréframkallande_E_coli_och_EHEC&oldid=3935"