Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

EJ REDIGERAD

PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI)

Analysprincip/teststrategi

Prov utodlas på medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utväxta bakterierna i primärstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

Tabell 31.

• Målgen Bakterietyp Amplimer

• stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
• stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
• eae EHEC/EPEC 376 (bp)
• ial EIEC/Shigella 320 (bp)
• bfpA EPEC 367 (bp)
• eltB ETEC 322 (bp)
• estA ETEC 147 (bp)

Reagens

Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.

Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.

dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.

Analysprocedur

• Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka 10e9-5x10e9 bakterier/mL).
• Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
• Koka röret i 20 minuter.
• Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100°C.
• Pelletera cellresterna.

PCR

• Mix / PCR-rör antal µL
  • GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
  • dNTP 1,25mmol/L 1,6
  • MgCl₂ 25mmol/L 1,2
  • Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
  • Taq 5U/µL 0,1
  • sterilt H₂O upp till 18,0 µL

Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.

• PCR-program

• • 4 min 96°C
  • 20 sek 94°C
  • 20 sek 55°C 30 cykler
  • 10 sek 72°C

7 min 72°C

Post-PCR

10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 mi-nu¬ter. Om stx1 eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

Referenser

• Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
• stx1 X07865
• stx2 X07865
• eae X60439
• bfpA Z12295
• eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
• estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
• ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256