PAR 02 Ziehl-Neelsen färgning
Mikroskopisk påvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isospora- oocystor efter modifierad Ziehl-Neelsen-färgning.
Analysprincip
Mikroskopisk påvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut på objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol, infärgas med karbolfuksin, avfärgas med saltsyra i etanol och bakgrundsfärgas med malakitgrönt. Oocystorna färgas röda mot en grön bakgrund.
Apparatur
- dragskåp
- automatpipett 10– 50 µL
- ljusmikroskop med objektiv 40x
- immersionsobjektiv (50x), 100x samt kalibrerat mätokular
Material
- objektglas med mattfält
- pipettspetsar 10–50 µL
- glaskyvett/färgställ
- pasteurpipetter plast
- avfallsburk
- täckglas
Reagens
- Metanol 99.8 %, CH3OH p.a.
- Karbolfuchsinlösning
Alternativ I
Färdigberedd Karbolfuchsinlösning, exempelvis Tbcolor från Merck
Alternativ II
Karbolfuchsinlösning (Ref 1)
Basiskt fuchsin 10 g
Etanol 99,5% 100 mL
Fenol 50 g
Destillerat vatten 1000 mL
Lös 10 g basiskt fuchsin i 100 mL etanol. Använd en flaska som rymmer minst 1500 mL. Väg upp 50 g fenol i en bägare och lös i en del av vattnet. Blanda alltsammans i flaskan. Sätt till resten av vattnet och blanda på nytt. Obsevera att fenol är toxiskt och frätande.
- Saltsyra i etanol (avfärgningslösning för Ziehl-Neelsen).
Blanda 10 mL konc HCl med 1990 mL 95 % etanol.
- Malakitgrönt 1 %
Lös 1 g malakitgrönt i 100 mL destillerat vatten.
- Positiv kontroll Cryptosporidium
Formalinfixerat fecesprov med Cryptosporidium-oocystor
- Immersionsolja för ljusmikroskop
Analysprocedur
Förbehandling av prover
Färgningen utförs i regel på koncentrerad feces. För koncentrering av feces se metodbeskrivning PAR 01. Fecesprover som innehåller rikligt med slem färgas även okoncentrerade.
Färgningsprocedur
Positiv kontroll skall ingå i varje färgningsomgång.
1. Märk objektglasets mattfält med labnummer.
2. Stryk ut ca 20 µL av provmaterialet på objektglaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter.
3. Låt preparatet lufttorka i minst 60 min.
4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock.
5. Lägg glaset på färgstället och täck med karbolfuchsin. Färga 20 min.
6. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.
7. Avfärga ett glas i taget med avfärgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda färgen är borta.
8. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.
9. Täck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min.
10. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.
11. Låt preparatet torka.
12. Montera eventuellt med DPX eller annan permanent monteringsbuffert och täckglas (ger hållbarare preparat). Låt torka.
Avläsning Granska hela preparatet. Använd 40x (förutsätter monterat preparat) eller 50x objektiv för översiktsgranskning och 100x immersionsobjektiv för verifiering. Mät storleken på eventuella oocystor med mätokular. För morfologiska kriterier av olika oocystor se under respektive parasit-avsnitt. Kvalitetssäkring Internkontroll Positiv kontroll: Fecesprov med känt innehåll av formaldehyd- eller SAF-fixerade Cryptosporidium-oocystor. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prover. För bildmaterial se referens 4 och 5. Externkontroll: UK-NEQAS feces-utskick Säkerhetsaspekter Iakttag försiktighet vid arbete med ej avdödat provmaterial. Behandling med 3,7 % formaldehyd under 30 min avdödar Cryptosporidium-oocystor. Referenser 1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987, 216-218. 2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995, 96-97. 3: UK-NEQAS Modified Ziehl_Neelsen http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Faecal_Scheme/Teaching_Information/Diagnostic_procedures/Permanent_stains/permanent_stains.html 4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora. 5. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fifth edition, 2007