PAR 04 Mikrosporidier
Mikroskopisk påvisning av microsporidia-sporer efter förstärkt trikromfärgning Analysprincip Mikroskopisk påvisning av microsporidia-sporer. Lufttorkade preparat fixeras med metanol, infärgas med modifierad trikromfärg, avfärgas och dehydreras. Avläsning sker i ljusmikroskop. Sporerna färgas rosa mot en blå bakgrund. Speciell utrustning ljusmikroskop med kalibrerat mätokular immersionsobjektiv 100 x Reagenser formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin) metanol 99 % förstärkt trikromfärg (Ryan-Blue) Alternativ 1. Färdig lösning, Trichrome Blue, från Meridian (ref 1) Alternativ 2. För egen beredning av reagens se referens 2, 3 eller 4. ättiksyra i etanol 90 % ättiksyra (isättika) 100 % 4,5 mL etanol 90% 995,5 mL etanol 95 %, etanol 99,5 % xylol alternativt xylol-substitut kompatibelt monteringsmedium immersionsolja Analysprocedur Förbehandling av provmaterial Feces: okoncentrerad feces fixerad i formaldehyd eller SAF. Lämplig spädning: 1 del feces till 3 delar fixativ. Mycket tunn fecesblandning centrifugeras och sedimentet används för utstryk. Färgningen kan också utföras på ofixerad feces spädd med 0,9 % NaCl eller annat provmaterial: sputum, BAL, urinsediment, ögonskrap etc. Färgningsprocedur Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll. Se under kvalitetssäkring. 1. Märk önskat antal objektglas. 2. Stryk med pipettspetsen ut ca 10 µL av provmaterialet. Gör mycket tunna utstryk. 3. Låt preparatet lufttorka. 4. Fixera glaset 5 min i metanol. 5. Placera glaset i trikromfärg. Låt stå 90 min i rumstemperatur. 6. Torka av färgöverskottet på glasets baksida mot en allduk. Tryck försiktigt glasets framsida mot allduken. 7. Avfärga i avfärgningslösning (ättikssyra i 90 % etanol) ungefär 5 sek. Låt överskott av vätska rinna av mot allduk mellan varje kyvett. 8. Skölj hastigt i 95 % etanol. 9. Låt stå i 95 % etanol 5 min. 10. Låt stå i 99,5 % etanol 10 min. 11. Låt stå i xylol alternativt xylolsubstitut 10 min. 12. Montera glaset med kompatibelt monteringsmedium och täckglas. Låt torka. Förvara glasen skyddade mot ljus. Granskning av preparat Granska 200 synfält med 100 x immersionsobjektiv. För morfologiska kriterier hänvisas till avsnittet om mikrosporidia. Kvalitetssäkring Intern Positiv kontroll som innehåller formalin eller SAF-fixerade microsporidiasporer. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prov. Intern panel innehållande färgade preparat med mikrosporidia-sporer Lämpligt bildmaterial finns under referens 4 och 5. Extern Ingår mycket sporadiskt i UK-NEQAS feces-utskick Svarsrutiner Negativt prov: Inga sporer påvisade Positivt prov: Sporer av Microsporidia påvisade REFERENSER 1. Meridian Diagnostics, Inc. Para-PacTrichrome Blue. Produktinformation
2. Ryan NJ, Sutherland G, Coughlan K, Globan M, Doultree, Marshall J, Baird, Pedersen J, Dwyer B. A new trichrome-blue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. 1993;31:3264-3269. 3. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. ASM Press, Washington 4. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago 5. Rondamelli EG, Scaglia M. Atlas of human protozoa. Masson 1993.