Bilaga 1: Realtids-PCR för påvisande av plasmidburen AmpC (ESBLM)

Bilaga 1: Realtids-PCR för påvisande av plasmidburen AmpC (ESBLM) med LightCycler (ej referensmetodik)

Den aktuella metoden är en modifierad variant av en multiplex PCR som i orginalutförande beskrevs av Perez-Perez (Ref). Den ursprungliga metoden beskrev påvisande av sex subgrupper av plasmidmedierad AmpC (pAmpC), men eftersom hittills två subgrupper (CIT och enstaka DHA) dominerar i Sverige, beskrivs nedan metod för påvisande av dessa. Metod för påvisande av övriga subgrupper kan erhållas från SMI. Provmaterial: Utväxta kolonier av bakterier tillhörande ’’Enterobacteriaceae’’ med fenotypisk misstanke om ESBLM kan användas som utgångsmaterial. 1. Instrument: LightCycler 2.1 Roche 2. Reagens: LightCycler Fast start DNA MasterPLUS SYBR Green 1 och H2O PCR-grade (båda Roche Diagnostics Scandinavia AB). 3. Primerpar: CIT: amplimer har storleken 462 bp DHA: amplimer har storleken 218 bp Primers 10 μM: CIT-F 5'-TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA-3' CIT-R 5’-TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC-3’ DHA-F 5’-AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T-3’ DHA-R 5’-GCT GCC ACT GCT GAT AGA A-3’ 4. Referensstammar: Art CCUG 58543 (CIT) Art CCUG 58545 (DHA) Metod- kontroll Vid varje analystillfälle testas förutom patientprov även (positiva kontroller) kontrollstammar CCUG 58543 (CIT, E Coli), CCUG 58545 (DHA, Klebsiella pneumoniae) och (negativa kontroller) som blankprov H2O PCR-grade (”PCR-rent vatten”) samt NTC (non template control, dvs PCR-mix utan templat).

Utförande Moment 1 (DNA-preparation, på PCR-lab):

1. Anteckna proverna och kontrollerna på ”Arbetsprotokoll för påvisande av ESBLm”. Skriv in för båda mixarna CIT och DHA. Räkna ut PCR-mix-blandningen (antal reaktioner +1). Använd Exel-bladet MIX-ESBLm som finns på skrivbordet i datorn skrivrummet.

2. Märk upp sterila Eppendorfrör 1,5mL. Ett rör för varje misstänkt isolat, ett för var kontrollstam och ett för vatten. Tillsätt 100 mL H2O PCR-grade till varje rör.

3. Lös upp 1 CFU i röret. Inkubera proven, 98ºC ,15 minuter i värmeblock.

4. Centrifugera 13 000 rpm i 5 minuter. Supernatanten är nu färdig att användas som templat. Förvara i kyl.

Moment 2 (Tillverkning av PCR-mix, på PCR-mixlab):

1. Master Mix SYBR green 1: För beredning se ”Preparation av Mastermix (LightCycler MRSA-screening)”. Den finns uppsatt på skåpdörren i mixrummet.

2. PCR-mix: Blanda en mix per komponent: antal rör + en NTC + en extra. Se arbetsprotokollet för den tänkta körningen.

       CIT         DHA             Komponent         Volym   per reaktion         Komponent         Volym   per reaktion             PCR-grade vatten         10   mL         PCR-grade vatten         10   mL             Primer CIT-F         0,5 mL            Primer DHA-F         0,5 mL                Primer CIT-R         0,5 mL            Primer DHA-R         0,5 mL                Mix SYBR green         4,0 mL         Mix SYBR green         4,0 mL             Totalt:         15 mL         Totalt         15 mL      

För övrigt se ”Uppspädning av primers och prober från SGS DNA” i Centuri.

Moment 3 (Provsättning och start av LightCycler):

Förberedelser: se metod ”Handhavandebeskrivning LightCycler 1.5”

1. Ta en transportburk ur frysen, i den transporteras PCR-mixen till rum 16. Använd LAF-bänken för sättning av templat till mix.

2. Hämta kylblocket i kylen rum 19. Placera kapillärer i hållarna. Pipettera 15 µL PCR-mix i varje kapillär-rör (enligt protokoll).

3. Tillsätt 5 µL templat (enligt protokoll) till kapillär-rören. Sätt lock på röret så fort templatet är pipetterat. NTC korkas utan tillsats.

4. Flytta kapillärerna till karusellen och centrifugera i karusellcentrifugen. Kontrollera nivån i kapillärerna genom att titta underifrån efter centrifugeringen, som kontroll på att det är rätt pipeterat.

5. Sätt karusellen i Lightcycler.

6. Välj program ESBLm och skriv in provnumren enligt protokoll.

7. Tryck Start Run och namnge körningen: ESBLm ÅÅMMDD/sign. Spara i experiments/ ESBLm ÅÅ. Klicka på SAVE.

PCR-program:

          Program         Target         Hold (mm:ss)         Ramp rate (ºC/s)         Acquisition Mode             Fast start         95º         10:00         20                       Amplification         95º         00:15         20         none                       57º         00:01         20         none           x 25                       72º         00:45         5         singel             Tm calling         95º         00:15         20         none                       60º         00:60         20         none                       95º         00:00         0,2         continuous             Cooling         40º         00:30         20         none      

Avläsning och bedömning Läs av amplifierings- och smältpunkts-kurvorna och skriv ut bilderna. Se metod ”Handhavandebeskrivning LightCycler 1.5”

Bedömning: 1. Kontrollera att kontrollerna slår som förväntat; CCUG 58543 (CIT) pos i CIT-mix och CCUG 58545 (DHA) positiv i DHA-mix.

2. Tm CIT bör ligga 90 +/- 1ºC, Tm DHA bör ligga 91 +/- 1ºC.

3. Tm kontroll-Tm prov ska vara +/- 1,00ºC för att säkerställa specificitet av PCR-produkt.

För verifierad genotypisk ESBLm krävs alltså:

A) Fenotypiska karaktäristika B) Tm +/- 1,00ºC från positiva kontrollen

Negativt utfall vid smältpunktsanalys tolkas som kromosomalt medierad ESBLm.

Positivt utfall vid smältpunktanalys tolkas som uttryck av CIT eller DHA. 1. Brolund A, Wisell KT, Edquist PJ, Elfstrom L, Walder M, Giske CG. Development of a real-time SYBRGreen PCR assay for rapid detection of acquired AmpC in Enterobacteriaceae. J Microbiol Methods. 2010 Sep;82(3):229-33. 2. Perez-Perez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR. J Clin Microbiol. 2002 Jun;40(6):2153-62. 3. Prövningsrapport Klinisk Mikrobiologi. [KML XIII:30 2011] pAmpC (ESBLm)