Direktmikroskopi och behandling av olika vävnadsmaterial-svamp
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner
Artikeln reviderad april 2010
Direktmikroskopi och behandling av olika vävnadsmaterial
Den främsta fördelen med direktmikroskopi är den snabbhet, med vilken man kan nå fram till en åtminstone preliminär diagnos. I synnerhet gäller detta vid infektion hos en immundefekt patient, där svampinfektionens utgång i stor utsträckning beror på med vilken snabbhet tillståndet kan diagnostiseras och antimykotisk behandling sättas in.
Direktmikroskopi med Blankophor- eller Calcofluor-fluorescens rekommenderas för att påvisa svamp i alla provmaterial (referensmetod). Blankophor och Calcofluor har affinitet till hexopyranosider i b-konfiguration, vilka förekommer i stor utsträckning i svampars cellvägg som glukaner, kitin och kitosan. Även textiltrådar och bindvävsfibriller blir fluorescerande.
Urin och tunna bronkvätskor centrifugeras 1500x g i 10 min. Blankophor tillsätts (se bilaga 2). Svampelementen fluorescerar då mot en huvudsakligen blek bakgrund. Jästceller har vanligen blåaktig fluorescens medan mögel och dermatofyter ofta är ljusgröna och Malassezia har gulaktig fluorescens.
Keratinhaltig vävnad
Prov från hud, naglar och hår behöver sönderdelas och digereras för att man skall komma åt att se de olika svampelementen. Först måste storleken på vävnadsbitarna minskas på mekanisk väg, vanligtvis med hjälp av en skalpell. När det gäller hår försöker man välja ut ett hårstrå med roten. I övrigt, och detta gäller allt hud- och nagelmaterial, blir urvalet mera slumpmässigt.
Små tunna vävnadsfragment placeras på ett objektglas och färgas med Blankophor-innehållande KOH. Ev. fordras lätt värmning av hud- och nagelpreparat för att lösa upp vävnad och synliggöra svampstrukturer. Utan uppvärmning tar upplösningen längre tid men kristallbildning undviks och preparatet blir mer lättavläst. Ett täckglas placeras ovanpå objektglaset och får stå 1-10 min (ev. värms lätt över bunsenbrännare), varefter provmaterialet pressas samman för att ge ett så tunt skikt som möjligt. Preparatet kan sedan betraktas i ett fluorescensmikroskop. Alternativt används en droppe av KOH/DMSO-blandning varefter materialet granskas i faskontrastmikroskop (se bilaga 2).
Tuschpreparat kan också användas för att synliggöra misstänkta kryptokocker, särskilt i likvor. Kryptokocker utan kapsel i nativt material uppges förekomma, men är sällsynta. Hos framodlade kryptokocker kan det förekomma att kapseln ej är synlig.
Tolkning
Om man undersöker hudskrap, bör riklig förekomst av korta, lätt böjda hyfer och små jästceller med bred knoppning väcka misstanke på pityriasis versicolor (se Tabell 7b). Färgning med laktofenolbomullsblått är ett snabbt och enkelt alternativ. Definitiv diagnos med hjälp av det mikroskopiska preparatet kan erhållas där man ser de typiska strukturerna som snabbt tar upp den blå färgen och är karakteristiska för Malassezia.
En annan mikroskopiskt karakteristisk bild är förekomsten av Scopulariopsis brevicaulis i naglar. Här kan man hitta såväl hyfer som de karakteristiska konidierna.
Fynd av hyalina hyfer som fragmenteras i oftast runda artrokonidier brukar vanligen vara tecken på förekomst av dermatofyter. När det gäller infektion i hår, vilken lättast iakttas nära roten, ger infektionens lokalisation ledning. Invasion i hårkärnan (endotrix med artrokonidier 4-8 mm i diameter) brukar oftast orsakas av Trichophyton tonsurans, T. schoenleinii, T. violaceum och T. soudanense. Infektion av hårets utsida (ectotrix) kan skiljas upp i sådan som orsakas av dermatofyter med små artrokonidier, 2-5 m m i diameter, vilka huvudsakligen är T. mentagrophytes, Microsporum canis, M. audouinii och M. gypseum, och sådan med stora artrokonidier 5-8 mm i diameter som bildas av T. verrucosum.
Fynd av knoppande celler och pseudohyfer talar för jästinfektion. Andra mycelbildande svampar, t.ex. Scytalidium kan ta olika former i vävnad och vara svåra att skilja från t ex Candida-hyfer och från dermatofyter i naglar, i synnerhet om svamparna har utsatts för antimykotikabehandling. Vid tinea nigra kan svampen Hortaea werneckii uppträda som rikligt förekommande, tätt packade mörkbruna hyfer, som visar upprepade förgreningar.
Hår- och hårbotteninfektioner orsakas nästan alltid av dermatofyter. Undantag är vanligtvis tropiskt förekommande svart och vit piedra. Vid svart piedra bildas små noduli längs håret och när dessa krossas och studeras i ljusmikroskopi ses bruna, septerade hyfer av Piedraia hortae. Hittar man de karakteristiska klubbformade sporsäckarna, som innehåller 2-8 spolformade askosporer med en enda spiralvriden tråd vid vardera polen, är detta diagnostiskt. Odling är då onödig. Vid vit piedra förekommer Trichosporon-arter, vilka kan finnas på normal hud. Mikroskopisk undersökning av den svullna noduli längs håret visar tätt packade hyalina hyfer och artrokonidier särskilt på utsidan av håret. Denna svamp är lättodlad till skillnad från P. hortae.
Direktmikroskopi ger vid ytliga infektioner en hög frekvens positiva fynd. Vid jämförelse med odling var endast 5 % av de odlingspositiva proven negativa i mikroskopi. Sannolikt kan de falskt negativa proven hänföras till att svampen är tämligen sparsamt förekommande i vävnaden och att man får relativt begränsad mängd provmaterial. Man fann också att 31 % av proven inte hade blivit diagnostiserade om endast odling hade utförts. Majoriteten av dessa prov (24 %) var naglar. Från 40-50 % av infekterade naglar växte inte svampen ut vid odling i synnerhet från distalt provmaterial. Kvarvarande 7 % av odlingsmisslyckandena var odling från epidermis, där antimykotisk medicinering kan ha varit en bidragande faktor. Det är en allmän erfarenhet, att prov tagna från händer, ansikte och fotsulor tenderar att ge falskt negativa odlingar oftare än de, som kommer från andra lokaler.
Sputum och bronksköljvätska
Undersökning av prov från nedre luftvägarna kompliceras ofta av att antalet infekterande organismer är litet, och att själva provet är segt. De flesta prov behöver därför lösas upp och koncentreras. Lika delar av provmaterial och acetylcystein blandas i ett centrifugrör och förses med lock. Röret Vortex-behandlas i ca 20 sek, varefter det kan stå i rumstemperatur i ungefär 5 min för att därefter centrifugeras som ovan. Om sputum inte löses upp med detta, kan ytterligare acetylcystein tillsättas. Efter detta centrifugeras provet vid ca 1500x g i 10 min. Supernatet avlägsnas och från sedimentet tas prov med ögla och färgas med Blankophor eller Calcofluor (se bilaga 2). Det är också möjligt att färga med laktofenolbomullsblått, varvid hyferna färgas blå, dock inte så starkt som för Malassezia. Behåll gärna ett utstryk för senare jämförelse med odlingsresultatet. En ögla material tas från sedimentet och sprids på ett objektglas, varefter detta värmefixeras.
Färdigberedd acetylcysteinlösning bör förvaras i kylskåp högst 48 tim. Som alternativ till acetylcystein kan ditiotreitol, 0,5 %, användas. Båda dessa medel är reduktionsmedel, varför onödigt tillträde av luft bör undvikas.
Tolkning
Candida albicans bildar knoppande jästceller och mycel eller pseudomycel som i luftvägsprov endast undantagsvis har klinisk relevans. Riklig växt beror ofta på antibiotikabehandling och att provmaterial från djupare luftvägar kontamineras vid passage i svalget.
Äkta hyfer med septa i avsaknad av jästceller härrör i Sverige nästan alltid från Aspergillus, särskilt A. fumigatus. Beroende på typ av infektion uppträder i viss mån Aspergillus-hyferna olika:
- Vid invasiv eller nekrotiserande aspergillos förekommer i vävnaden ofta välutvecklade, septerade, dikotomt förgrenade hyfer i tämligen riklig mängd. Hyfstrukturerna är relativt regelbundna och ger ett intryck av god tillväxt.
- Vid allergisk bronkopulmonell aspergillos, som ofta går med astma och eosinofili samt lungröntgenförändringar, kan man vid exacerbationer ofta hitta Aspergillus-hyfer i slempluggar från bronkerna. Svamphyferna liknar här i viss utsträckning de som förekommer vid invasiv aspergillos.
De för Aspergillus karakteristiska sporhuvudena bildas endast i aerob miljö och ses därför sällan i vävnad. Vid lunginfektioner kan de dock förekomma, när Aspergillus växer ut i luftfyllda hålrum som t.ex. bronker och kaverner.
Zygomycetes har karakteristiska, breda, bandliknande hyfer utan septa, som kan invadera lungan, i synnerhet vid immunsuppression, diabetes och njurinsufficiens.
Den i Sverige vanligaste luftvägsinfektionen med jästsvamp, som har sin ingångsport via lungan, är kryptokockinfektionen. I detta stadium av infektionen påvisas tämligen sällan knoppande kapselförsedda jästceller av karakteristiskt utseende i sputum. För de i Sverige sällan förekommande geografiskt endemiska svampinfektionerna med ingångsport via lungorna eller med lungengagemang som B. dermatitidis, C. posadii tidigare C. immitis, H. capsulatum, P. brasiliensis och P. marneffei hänvisas till Tabell 7.
Cerebrospinalvätska
Jästarter som orsakar meningit kan förekomma i låga koncentrationer i likvor, vilket gör att man bör ta ca. 5 mL likvor som centrifugeras. Sediment används för odling och direktmikroskopi (bilaga 2 och ref. LJR Milne). Supernatet som erhålls efter centrifugeringen av likvor används för påvisande av kryptokockantigen, vilket är en avsevärt känsligare test än mikroskopering. (Se Referensmetodik I 9 - Infektioner i centrala nervsystemet - CNS)
Tolkning
Jästcellens kapsel framträder som en ljus halo mot tuschens mörka kolpartiklar, vilka visar intensiv Brownsk rörelse. Leukocyter kan ge liknande fenomen men utan motsvarighet till distinkt jästcell inuti kapseln samt luddig yttre gräns för kapseln. Icke-kapslade kryptokocker har dock påvisats i preparat från AIDS-patienter.
Patienter med AIDS och andra immunkomprometterade tillstånd kan ha höga koncentrationer kryptokocker och samtidigt obetydlig inflammatorisk reaktion.
Vävnad
Vävnad kan tas från de flesta organ och behandlas på ungefär samma sätt. I vävnad där svampinfektion misstänks kan man göra avtryckspreparat ("imprint") genom att lägga ett snitt genom den misstänkta vävnaden och trycka snittytan mot ett objektglas upprepade gånger. Ett glas bör göras för gramfärgning och ett för histopatologisk färgning t.ex. enl. Grocott vilken är bättre för svamp. Samma vävnadsstycke kan därefter trimmas ner till tunna bitar i storleksordning 1/2-1 mm och placeras på ett objektglas och färgas med Blankophor eller Calcofluor (bilaga 2).
Tolkning
All djupare humanvävnad är normalt fri från svampmaterial, vilket gör att svampfynd bör betraktas som något onormalt. Av de biopsier som tas från slemhinnor, är de från esofagus vanligast. Fynd av jästceller tillsammans med pseudomycel i vävnaden talar för Candida-infektion, vanligtvis C. albicans. Fynd av jästceller utan pseudomycel kan även vara ett tecken på Candida-infektion, även om diagnosen då är något mindre säker.
Biopsier från luftvägarna, t.ex. sinus, öppen lungbiopsi och lungor i samband med obduktion visar vid de flesta positiva svampfynd Aspergillus-hyfer. För övriga agens se tidigare avsnitt i detta kapitel.
De svamparter, som orsakar kromoblastomykos, kan påvisas i hudskrap och granulomatös vävnad, men är svårare i subkutana förändringar. Här förekommer sparsamt med tjockväggiga celler, ofta delade i två eller tetrader och påfallande genom sin bruna färg vilken syns vid ljusmikroskopi (bilaga 2). Silverfärgning enligt Grocott ökar vanligtvis kontrasten mot bakgrundsvävnaden.
Pus och andra exsudat
Provutstryk görs på objektglas för ev. färgning enligt Grocott. En ögla material färgas med Blankophor eller Calcofluor och granskas i fluorescensmikroskop, behandlas alternativt med KOH/DMSO, varvid faskontrast- eller ljusmikroskop används för granskning (bilaga 2).
Tolkning
Då fistlar med exsudat förekommer på extremiteterna och mycetom kan misstänkas, bör även förekomst av granulae undersökas. Granulae består av en kompakt massa mycel och har en storlek på upp till 2 mm. Färgen på granulae kan vara vit, gul, brun, röd eller svart och bör noteras som ett diagnostiskt hjälpmedel. Eftersom granulae kan vara uppbyggda av såväl aktinomyceter som äkta mycel, är gramfärgningen viktig (Tabell 6). Bakterier förekommer som fina, (1 mm eller mindre) förgrenade, grampositiva trådar. Odling är nödvändig för att identifiera agens (Tabell 5).
Fynd av svamp på bomullspinne kan vara till diagnostisk hjälp, men metoden är mycket okänslig och rekommenderas ej. Inte ens vid misstänkt Candida-vaginit är känsligheten högre än ca 50 % av den vid mikroskopi jämfört med odling.
Urin och andra kroppsvätskor
Efter centrifugering görs ett utstryk från sedimentet för Blankophor- eller Calcofluorfärgning (bilaga 2).
Tolkning
Fynd av jästceller eller hyfer i ascites, peritonealdialysvätska och andra normalt sterila vätskor bör rapporteras direkt till kliniken. Urin däremot kan kontamineras vid provtagningen från uretra, vagina eller preputiet, varför inte alla fynd i urin är representativa för en urinvägsinfektion med svamp. Högt antal Candida-celler ses inte sällan i urinodlingar från patienter med KAD. Detta är vanligen ett tecken på kolonisation av katetern eller uretra snarare än urinvägsinfektion. Förekomst av svamp i urin kan emellertid också vara ett tecken på en disseminerad infektion hos en disponerad patient.