Skillnad mellan versioner av "Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
(Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002'' ---- '''EJ REDIGERAD''' == PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI) == …')
 
 
(7 mellanliggande sidversioner av en annan användare visas inte)
Rad 4: Rad 4:
 
'''EJ REDIGERAD'''
 
'''EJ REDIGERAD'''
  
−
== PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI) ==
+
== PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (Folkhälsomyndigheten) ==
  
  
Rad 17: Rad 17:
 
*'''Målgen Bakterietyp Amplimer'''
 
*'''Målgen Bakterietyp Amplimer'''
  
−
*stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
+
*''stx1'' EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
−
*stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
+
*''stx2 ''EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
−
*eae EHEC/EPEC 376 (bp)
+
*''eae ''EHEC/EPEC 376 (bp)
−
*ial EIEC/Shigella 320 (bp)
+
*''ial ''EIEC/''Shigella ''320 (bp)
−
*bfpA EPEC 367 (bp)
+
*''bfpA ''EPEC 367 (bp)
−
*eltB ETEC 322 (bp)
+
*''eltB ''ETEC 322 (bp)
−
*estA ETEC 147 (bp)
+
*''estA ''ETEC 147 (bp)
  
  
−
Reagens
 
−
Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.
 
−
Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.
 
  
−
AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.
+
=== Reagens ===
−
dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.
 
  
 +
'''Kontroller ([[Diarréframkallande Escherichia coli-laboratoriediagnostik|tabell 17]])''' slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.
  
 +
Negativ kontroll ''E.coli'' ATCC 11775.
  
 +
AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.
  
 +
dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.
  
  
−
Tabell 32.  
+
[[Fil:Fecestabell32.jpg]]
  
−
Målgen Primer Primersekvens
+
==== Analysprocedur ====
  
−
eltB LT 1 5'TCT CTA TGT GCA TAC GGA GC3'
+
*Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka <math>10^9</math>-5x<math>10^9</math> bakterier/mL).
−
eltB LT r 5'CCA TAC TGA TTG CCG CAA T3'
+
*Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
−
estA STI2 1 5'GCT AAA CCA GTA GAGG TCT TCA AAA3'
+
*Koka röret i 20 minuter.
−
estA STI2 r 5'CCC GGT ACA GAGC AGG ATT ACA ACA3'
+
*Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100 °C.
−
stx1 VT1 l 5'GAA GAG TCC GTG GGA TTA CG3'
+
*Pelletera cellresterna.
−
stx1 VT1 r 5'AGC GAT GCA GCT ATT AAT AA3'
 
−
stx2 VT2 l 5'ACC GTT TTT CAG ATT TTGA CAC ATA3'
 
−
stx2 VT2 r 5'TAC ACA GGA GCA GTT TCA GAC AGT3'
 
−
eae eae u 5'CAC ACG AAT AAA CTG ACT AAA ATG3'
 
−
eae eae 1 5'AAA AAC GCT GAC CCG CAC CTA AAT3'
 
−
ial SHIG 1 5'CTG GTA GGT ATG GTG AGG3'
 
−
ial SHIG 2 5'CCA GGC CAA CAA TTA TTT CC3'
 
−
bfp A bfpA2 u 5'TTC TTG GTG CTT GCG TGT CTT TT3'
 
−
bfp A bfpA2 1 5'TTT TGT TTG TTG TAT CTT TGT AA3'
 
  
−
GA= en blandning av lika delar dGTP och dATP i samma position.
+
=== PCR ===
−
I EHEC-PCR ingår två primermixar, Stx1+2- och eae-mix.
 
−
I EPEC-PCR ingår också två primermixar, bfpA2- och eae-mix .
 
  
−
Analysprocedur
+
*'''Mix / PCR-rör antal µL'''
−
Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (ca. 109-5x109 bakterier/ml).
+
**GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
−
Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
+
**dNTP 1,25mmol/L 1,6
−
Koka röret i 20 minuter.
+
**MgCl<sub>2</sub> 25mmol/L 1,2
−
Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100°C.
+
**Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
−
Pelletera cellresterna.
+
**Taq 5U/µL 0,1
 +
**sterilt H<sub>2</sub>O upp till 18,0 µL
  
  
 +
Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.
  
  
  
 +
*'''PCR-program'''
  
 +
**4 min 96°C
 +
**20 sek 94°C
 +
**20 sek 55°C               30 cykler
 +
**10 sek 72°C
  
−
PCR:
+
7 min 72°C
−
Mix / PCR-rör antal µL
 
−
GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
 
−
dNTP 1,25mmol/L 1,6
 
−
MgCl2 25mmol/L 1,2
 
−
Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
 
−
Taq 5U/µL 0,1
 
−
sterilt H2O upp till 18,0 µL
 
  
−
Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.
 
  
−
PCR-program:
+
=== Post-PCR ===
  
−
4 min 96°C
+
10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 minuter. Om ''stx''1 eller ''estA'' (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.
−
 
 
−
20 sek 94°C
 
−
20 sek 55°C               30 cykler
 
−
10 sek 72°C
 
−
 
 
−
7 min 72°C
 
  
−
Post-PCR
+
== REFERENSER ==
−
10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosg¬el-elektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 mi-nu¬ter. Om stx1eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaros-halten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.
 
  
−
Referenser
+
*'''Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas'''
−
Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
+
*''stx1'' X07865
−
''stx1'' X07865
+
*''stx2'' X07865
−
''stx2'' X07865
+
*''eae'' X60439
−
''eae'' X60439
+
*''bfpA'' Z12295
−
''bfpA'' Z12295
+
*  ''eltB'' Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of ''E.coli'' pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
−
  eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
+
* ''estA'' Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an ''E.coli'' heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
−
estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
+
*  ''ial'' Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of ''Shigella'' in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
−
  ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
 
  
  
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]

Nuvarande version från 14 januari 2014 kl. 16.04

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

EJ REDIGERAD

PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (Folkhälsomyndigheten)[redigera]

Analysprincip/teststrategi[redigera]

Prov utodlas på medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utväxta bakterierna i primärstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

Tabell 31.

  • Målgen Bakterietyp Amplimer
  • stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
  • stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
  • eae EHEC/EPEC 376 (bp)
  • ial EIEC/Shigella 320 (bp)
  • bfpA EPEC 367 (bp)
  • eltB ETEC 322 (bp)
  • estA ETEC 147 (bp)


Reagens[redigera]

Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.

Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.

dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.


Fecestabell32.jpg

Analysprocedur[redigera]

  • Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka -5x bakterier/mL).
  • Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
  • Koka röret i 20 minuter.
  • Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100 °C.
  • Pelletera cellresterna.

PCR[redigera]

  • Mix / PCR-rör antal µL
    • GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
    • dNTP 1,25mmol/L 1,6
    • MgCl2 25mmol/L 1,2
    • Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
    • Taq 5U/µL 0,1
    • sterilt H2O upp till 18,0 µL


Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.


  • PCR-program
    • 4 min 96°C
    • 20 sek 94°C
    • 20 sek 55°C 30 cykler
    • 10 sek 72°C

7 min 72°C


Post-PCR[redigera]

10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 minuter. Om stx1 eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

REFERENSER[redigera]

  • Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
  • stx1 X07865
  • stx2 X07865
  • eae X60439
  • bfpA Z12295
  • eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
  • estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
  • ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Bilaga_3._PCR-diagnostik_av_diarréframkallande_E_coli_och_EHEC&oldid=13410"