Skillnad mellan versioner av "Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
Rad 17: Rad 17:
 
*'''Målgen Bakterietyp Amplimer'''
 
*'''Målgen Bakterietyp Amplimer'''
  
−
*stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
+
*''stx1'' EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
−
*stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
+
*''stx2 ''EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
−
*eae EHEC/EPEC 376 (bp)
+
*''eae ''EHEC/EPEC 376 (bp)
−
*ial EIEC/Shigella 320 (bp)
+
*''ial ''EIEC/''Shigella ''320 (bp)
−
*bfpA EPEC 367 (bp)
+
*''bfpA ''EPEC 367 (bp)
−
*eltB ETEC 322 (bp)
+
*''eltB ''ETEC 322 (bp)
−
*estA ETEC 147 (bp)
+
*''estA ''ETEC 147 (bp)
  
  
−
Reagens
 
−
Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.
 
−
Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.
 
  
−
AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.
+
=== Reagens ===
−
dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.
 
  
 +
'''Kontroller (tabell 17)''' slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.
  
 +
Negativ kontroll ''E.coli'' ATCC 11775.
  
 +
AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.
  
 +
dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.
  
  
−
Tabell 32.  
+
[[Fil:Fecestabell32.jpg]]
  
−
Målgen Primer Primersekvens
+
==== Analysprocedur ====
  
−
eltB LT 1 5'TCT CTA TGT GCA TAC GGA GC3'
+
*Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka 10e9-5x10e9 bakterier/mL).
−
eltB LT r 5'CCA TAC TGA TTG CCG CAA T3'
+
*Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
−
estA STI2 1 5'GCT AAA CCA GTA GAGG TCT TCA AAA3'
+
*Koka röret i 20 minuter.
−
estA STI2 r 5'CCC GGT ACA GAGC AGG ATT ACA ACA3'
+
*Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100°C.
−
stx1 VT1 l 5'GAA GAG TCC GTG GGA TTA CG3'
+
*Pelletera cellresterna.
−
stx1 VT1 r 5'AGC GAT GCA GCT ATT AAT AA3'
 
−
stx2 VT2 l 5'ACC GTT TTT CAG ATT TTGA CAC ATA3'
 
−
stx2 VT2 r 5'TAC ACA GGA GCA GTT TCA GAC AGT3'
 
−
eae eae u 5'CAC ACG AAT AAA CTG ACT AAA ATG3'
 
−
eae eae 1 5'AAA AAC GCT GAC CCG CAC CTA AAT3'
 
−
ial SHIG 1 5'CTG GTA GGT ATG GTG AGG3'
 
−
ial SHIG 2 5'CCA GGC CAA CAA TTA TTT CC3'
 
−
bfp A bfpA2 u 5'TTC TTG GTG CTT GCG TGT CTT TT3'
 
−
bfp A bfpA2 1 5'TTT TGT TTG TTG TAT CTT TGT AA3'
 
  
−
GA= en blandning av lika delar dGTP och dATP i samma position.
 
−
I EHEC-PCR ingår två primermixar, Stx1+2- och eae-mix.
 
−
I EPEC-PCR ingår också två primermixar, bfpA2- och eae-mix .
 
  
−
Analysprocedur
+
=== PCR ===
−
Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (ca. 109-5x109 bakterier/ml).
 
−
Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
 
−
Koka röret i 20 minuter.
 
−
Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100°C.
 
−
Pelletera cellresterna.
 
  
 +
*'''Mix / PCR-rör antal µL'''
 +
**GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
 +
**dNTP 1,25mmol/L 1,6
 +
**MgCl<sub>2</sub> 25mmol/L 1,2
 +
**Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
 +
**Taq 5U/µL 0,1
 +
**sterilt H<sub>2</sub>O upp till 18,0 µL
  
  
 +
Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.
  
  
  
 +
*'''PCR-program'''
  
−
PCR:
+
**4 min 96°C
−
Mix / PCR-rör antal µL
+
**20 sek 94°C
−
GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
+
**20 sek 55°C               30 cykler
−
dNTP 1,25mmol/L 1,6
+
**10 sek 72°C
−
MgCl2 25mmol/L 1,2
 
−
Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
 
−
Taq 5U/µL 0,1
 
−
sterilt H<sub>2</sub>O upp till 18,0 µL
 
  
−
Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.
+
7 min 72°C
−
 
 
−
PCR-program:
 
  
−
4 min 96°C
 
  
−
20 sek 94°C
+
=== Post-PCR ===
−
20 sek 55°C               30 cykler
 
−
10 sek 72°C
 
  
−
7 min 72°C
+
10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 mi-nu¬ter. Om ''stx''1 eller ''estA'' (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.
  
−
Post-PCR
+
=== Referenser ===
−
10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosg¬el-elektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 mi-nu¬ter. Om stx1eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaros-halten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.
 
  
−
Referenser
+
*'''Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas'''
−
Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
+
*''stx1'' X07865
−
''stx1'' X07865
+
*''stx2'' X07865
−
''stx2'' X07865
+
*''eae'' X60439
−
''eae'' X60439
+
*''bfpA'' Z12295
−
''bfpA'' Z12295
+
*  ''eltB'' Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of ''E.coli'' pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
−
  eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
+
* ''estA'' Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an ''E.coli'' heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
−
estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
+
*  ''ial'' Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of ''Shigella'' in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
−
  ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
 
  
  
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm ]]

Versionen från 13 december 2009 kl. 12.14

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

EJ REDIGERAD

PCR-diagnostik av EHEC, EIEC, EPEC och ETEC (SMI)

Analysprincip/teststrategi

Prov utodlas på medium som selekterar för gramnegativa aeroba bakterier. De utväxta bakterierna i primärstryk eller enskilda kolonier slammas, kokas, och analyseras med PCR.

Tabell 31.

  • Målgen Bakterietyp Amplimer
  • stx1 EHEC/Shiga-/verotoxigena 130 (bp)
  • stx2 EHEC/Shiga-/verotoxigena 298 (bp)
  • eae EHEC/EPEC 376 (bp)
  • ial EIEC/Shigella 320 (bp)
  • bfpA EPEC 367 (bp)
  • eltB ETEC 322 (bp)
  • estA ETEC 147 (bp)


Reagens

Kontroller (tabell 17) slammas i PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (undantag ATCC 43890 som slammas till 8). Templat-DNA från de två EHEC stammarna blandas i förhållandet 1+1.

Negativ kontroll E.coli ATCC 11775.

AmpliTaq, Taq polymeras 5 U/µL, GeneAmp 10xPCR-buffert II & 25 mmol/L MgCl2, Perkin Elmer.

dNTP; dATP, dCTP, dGTP och dTTP, ultrapure.


Fecestabell32.jpg

Analysprocedur

  • Slamma bakterieväxten från primärstryket på en sorbitol-MacConkey-agarplatta i rör med PBS till en täthet motsvarande MacFarland 4 (cirka 10e9-5x10e9 bakterier/mL).
  • Om bara ett fåtal kolonier vuxit ut eller isolat analyseras, slamma en koloni per 40µL PBS.
  • Koka röret i 20 minuter.
  • Reaktionsrör med 40µL bakterieslammning behandlas i 10 minuter vid 98-100°C.
  • Pelletera cellresterna.


PCR

  • Mix / PCR-rör antal µL
    • GeneAmp 10x PCR buffert II 2,0
    • dNTP 1,25mmol/L 1,6
    • MgCl2 25mmol/L 1,2
    • Primer av varje 2,5µmol/L 0,4
    • Taq 5U/µL 0,1
    • sterilt H2O upp till 18,0 µL


Tillsätt 2µL templat-DNA (prover resp. kontroller) till resp.PCR-rör.


  • PCR-program
    • 4 min 96°C
    • 20 sek 94°C
    • 20 sek 55°C 30 cykler
    • 10 sek 72°C

7 min 72°C


Post-PCR

10 µL av reaktionsvolymen från varje rör analyseras med agarosgelelektrofores, motsvarande 2 % agaros (Seakem GTG) 120V, 30 mi-nu¬ter. Om stx1 eller estA (130bp resp.147bp) är svaga kan agaroshalten ökas för att ge skarpare band. Analysen påvisar närvaro eller frånvaro av de amplimerer som anges i tabell 31.

Referenser

  • Målgen Åtkomstnummer EMBL DNA-databas
  • stx1 X07865
  • stx2 X07865
  • eae X60439
  • bfpA Z12295
  • eltB Ref: Yamamote, T. And Yokota. 1983. Sequence of heatlabile enterotoxin of E.coli pathogenic to humans. J. Biol. Chem. 259, 5037-5044.
  • estA Ref: Stieglitz H, Cervantes L, Robledo R, Covarrubias L, Bolivar F and Kupersztoch YM 1988. Cloning, sequencing and expression in Ficoll-generated minicells of an E.coli heat-stable enterotoxin gene. Plasmid 20, 42-53.
  • ial Ref: Frankel G, Riley L, Giron J et al. 1990. Detection of Shigella in faeces using DNA amplification. J. Inf. Dis. 161, 1252-1256
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Bilaga_3._PCR-diagnostik_av_diarréframkallande_E_coli_och_EHEC&oldid=4157"