Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept
Sekundärartikel till Tuberkulos-laboratoriediagnostik
Mykobakterier; substrat- och reagensrecept
Löwenstein-Jensen medium (OBS! 3 tillverkningsdagar) Dag 1 1. Lutlösning, saltlösning och malakitgröntlösning prepareras (se nedan). Dag 2 1. Ägg (32 st per hel sats) placeras i hinkar. 2. Lutlösningen hälls över äggen (glasögon och handskar). 3. Efter 3 timmar hälls lutlösningen av, varefter äggen sköljs med rinnande vatten i 4 timmar. 4. Vattnet hälls av och äggen får stå i kyl 4 ºC över natten. Dag 3 1. Äggen tas upp med sterila handskar och slås upp, ett i taget, i en steril bägare. Kontrollera att inget är skämt. Äggen vispas ihop med en steril visp. 1340 mL ägglösning hälls ned i en steril 5 L E-kolv och skakas i skakmaskin 10 minuter. 2. En sats saltlösning och 26 mL malakitgröntlösning tillsätts. 3. Skakas i skakmaskin 10 minuter. Blandningen filtreras genom gasväv (steril) och får vila i 20-30 minuter. 4. Dispenseras i sterila odlingsrör. 5. Mediet koaguleras i värmeskåp 80-85 ºC 1 timme.
Lutlösning Till 2 hinkar med 8-10 L vatten tillsätt ≈ 100 mL lutpastiller NaOH, som får lösa sig till följande dag. OBS! Glasögon och handskar måste användas vid hanteringen av lutlösningen.
Saltlösning Kalium-di-vätefosfat KH2PO4 3,2 g Magnesiumfosfat MgSO4x7H2O 0,32 g Tri-Magnesium-dicitrat C12H10Mg3O14x14 H2O 0,8 g L-Aspargin 4,8 g Glycerol 16,0 mL 1 M HCl 50,0 mL Avjoniserat vatten 700,0 mL
1. Saltlösningen vägs upp i 1500 mL E-kolv. 2. Värms till nästan kokpunkt. 3. 40 g potatisstärkelse löses i 100 mL avjoniserat vatten. 4. Stärkelselösningen tillsätts under omskakning. 5. Autoklaveras i 20 minuter, 120 ºC. 6. Efter autoklavering förvaras kolvarna i rumstemperatur.
Malakitgrönt 2 % lösning Malakitgrönt-oxalat 3,0 g Avjoniserat vatten 150 mL
1. Malakitgrönt-oxalat vägs upp i 300 mL glasflaska. 2. Avjoniserat vatten tillsätts. 3. Flaskan placeras i vattenbad med kokande vatten. 4. Flaskan skakas då och då tills pulvret gått i lösning.
Reagens för dekontaminering av prov
Natriumlaurylsulfatlösning
Natrium laurylsulfat 99,9 % 45 g
Avjoniserat vatten 1500 mL
Natriumhydroxid, NaOH 15 g
Laurylsulfatet löses i ca 60 ºC vatten, NaOH tillsätts innan utfällningen börjar. Använd mycket rena kärl. Fylls med ca 750 mL på 1 liters flaskor och autoklaveras i 120 ºC i 20 min. Ställs i 37 ºC termostat snarast.
Neutralisationslösning för dekontaminering
Svavelsyra H2SO4 konc. (98 %) 0,9 mL
Avjoniserat vatten 1000 mL
Bromkresolpurpur 1 % 0,8 mL
Blandas, fylles med ca 1000 mL på 1 liters flaskor. Autoklaveras 120 º C i 20 minuter.
Reagens för fluorescensmikroskopi Auramin Auramin 3,0 g Fenol 32 mL H2O 968 mL
Syra-alkohol lösning. 3,0 mL koncentrerad HCl adderas långsamt till 97,0 mL 90-95 % etanol (stark värme kan utvecklas).
Reagens för Hallbergfärgning Stamlösningar Nachtblaulösning Nachtblau 5 g 95 % alkohol 100 mL K2SO4-lösning K2SO4 4 g Aq dest 100 g Brukslösningar Nachtblaulösning Aq dest 405 mL K2SO4-lösning 4,5 mL Nachtblaulösning 45 mL Nachtblaulösning måste efter hopblandningen upphettas till 75 º-80 ºC innan den används. Fuchsinlösning Fuchsin 1 g (för kontrastfärgning) 70 % alkohol 1000 mL
PANTA
Polymyxin B 50 enheter/mL Amfotericin 5 mg/L Nalixidinsyra 20 mg/L Trimetoprim 5 mg/L Azlocillin 10 mg/L Färdig lösning kan köpas från Becton Dickinson.