Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök

Sekundärartikel till Tuberkulos-laboratoriediagnostik

Mykobakterier; substrat- och reagensrecept

Löwenstein-Jensen medium

(OBS! 3 tillverkningsdagar)

  • Dag 1
    • 1. Lutlösning, saltlösning och malakitgröntlösning prepareras (se nedan).
  • Dag 2
    • 1. Ägg (32 st per hel sats) placeras i hinkar.
    • 2. Lutlösningen hälls över äggen (glasögon och handskar).
    • 3. Efter 3 timmar hälls lutlösningen av, varefter äggen sköljs med rinnande vatten i 4 timmar.
    • 4. Vattnet hälls av och äggen får stå i kyl 4 ºC över natten.
  • Dag 3
    • 1. Äggen tas upp med sterila handskar och slås upp, ett i taget, i en steril bägare. Kontrollera att inget är skämt. Äggen vispas ihop med en steril visp. 1340 mL ägglösning hälls ned i en steril 5 L E-kolv och skakas i skakmaskin 10 minuter.
    • 2. En sats saltlösning och 26 mL malakitgröntlösning tillsätts.
    • 3. Skakas i skakmaskin 10 minuter. Blandningen filtreras genom gasväv (steril) och får vila i 20-30 minuter.
    • 4. Dispenseras i sterila odlingsrör.
    • 5. Mediet koaguleras i värmeskåp 80-85 ºC 1 timme.

Lutlösning: Till 2 hinkar med 8-10 L vatten tillsätt ≈ 100 mL lutpastiller NaOH, som får lösa sig till följande dag. OBS! Glasögon och handskar måste användas vid hanteringen av lutlösningen.

  • Saltlösning
    • Kalium-di-vätefosfat KH2PO4 3,2 g
    • Magnesiumfosfat MgSO4x7H2O 0,32 g
    • Tri-Magnesium-dicitrat C12H10Mg3O14x14 H2O 0,8 g
    • L-Aspargin 4,8 g
    • Glycerol 16,0 mL
    • 1 M HCl 50,0 mL
    • Avjoniserat vatten 700,0 mL
  • 1. Saltlösningen vägs upp i 1500 mL E-kolv.
  • 2. Värms till nästan kokpunkt.
  • 3. 40 g potatisstärkelse löses i 100 mL avjoniserat vatten.
  • 4. Stärkelselösningen tillsätts under omskakning.
  • 5. Autoklaveras i 20 minuter, 120 ºC.
  • 6. Efter autoklavering förvaras kolvarna i rumstemperatur.
  • Malakitgrönt 2 % lösning
    • Malakitgrönt-oxalat 3,0 g
    • Avjoniserat vatten 150 mL
  • 1. Malakitgrönt-oxalat vägs upp i 300 mL glasflaska.
  • 2. Avjoniserat vatten tillsätts.
  • 3. Flaskan placeras i vattenbad med kokande vatten.
  • 4. Flaskan skakas då och då tills pulvret gått i lösning.

Reagens för dekontaminering av prov

  • Natriumlaurylsulfatlösning
    • Natrium laurylsulfat 99,9 % 45 g
    • Avjoniserat vatten 1500 mL
    • Natriumhydroxid, NaOH 15 g

Laurylsulfatet löses i ca 60 ºC vatten, NaOH tillsätts innan utfällningen börjar. Använd mycket rena kärl. Fylls med ca 750 mL på 1 liters flaskor och autoklaveras i 120 ºC i 20 min. Ställs i 37 ºC termostat snarast.


  • Neutralisationslösning för dekontaminering
    • Svavelsyra H2SO4 konc. (98 %) 0,9 mL
    • Avjoniserat vatten 1000 mL
    • Bromkresolpurpur 1 % 0,8 mL

Blandas, fylles med ca 1000 mL på 1 liters flaskor. Autoklaveras 120 º C i 20 minuter.


Reagens för fluorescensmikroskopi

  • Auramin
    • Auramin 3,0 g
    • Fenol 32 mL
    • H2O 968 mL


  • Syra-alkohol lösning.
    • 3,0 mL koncentrerad HCl adderas långsamt till 97,0 mL 90-95 % etanol (stark värme kan utvecklas).


Reagens för Hallbergfärgning

  • Stamlösningar
    • Nachtblaulösning
    • Nachtblau 5 g
      • 95 % alkohol 100 mL
    • K2SO4-lösning K2SO4 4 g
      • Aq dest 100 g
  • Brukslösningar
    • Nachtblaulösning, bruks
    • Aq dest 405 mL
    • K2SO4-lösning 4,5 mL
    • Nachtblaulösning 45 mL

Nachtblaulösning måste efter hopblandningen upphettas till 75 º-80 ºC innan den används.

  • Fuchsinlösning
    • Fuchsin 1 g
    • (för kontrastfärgning) 70 % alkohol 1000 mL


  • PANTA
    • Polymyxin B 50 enheter/mL
    • Amfotericin 5 mg/L
    • Nalixidinsyra 20 mg/L
    • Trimetoprim 5 mg/L
    • Azlocillin 10 mg/L


Färdig lösning kan köpas från Becton Dickinson.

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Bilaga_6_Mykobakterier;_substrat-och_reagensrecept&oldid=3374"