PAR 01 Cystor och maskägg, feceskoncentration

Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces

Analysprincip

Formalinfixerad feces filtreras, skakas med etylacetat och centrifugeras för att separera maskägg, larver, cystor och oocystor från fett och skräp. Efter centrifugering bildas fyra skikt: i botten av röret ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg med skräp och överst en etylacetatfas. Sedimentet granskas i ljusmikroskop. Materialet i sedimentet kan även användas till olika specialfärgningar för att identifiera specifika parasiter. Metoden är inte lämplig för påvisning av trofozoiter i feces.

Apparatur

Dragskåp/dragbänk centrifug (skakapparat) ljusmikroskop med kalibrerat mätokular objektiv 10x, 20/25x, 40x

Material

träpinnar med och utan bomull gasväv engångsmuggar plast graderade koniska centrifugrör av plast med tillhörande lock (OBS! plasten måste tåla etylacetat) provrörsställ pipett 5 eller 10 mL pipettfyllare objektglas täckglas

Reagenser

• Formaldehydlösning 3,7 % (=10% formalin)
• Etylacetat C4H8O2 p.a.

Märkning: brandfarligt, hälsovådligt Förvaring: dragskåp eller ventilerat kemikalieskåp

• D'Antonis jodlösning (ref 1)

Lös 1,0 g kaliumjodid och 1,5 g jodkristaller i 100 mL destillerat vatten. Använd magnetomrörare. En del kristaller förblir olösta. Förvaras i mörk flaska. Filtreras innan användning. Hållbar 1 år.

• Natriumklorid 0,9 %

Analysprocedur

1. Blanda en sked (ca 1 gram) feces med 7 mL 3,7 % formaldehyd i ett märkt rör. (Observera att detta moment redan är utfört på de prov som sänts in i formaldehyd eller SAF-fixativ). Blanda provet noggrant med ett par träpinnar.

2. Låt stå 30 min för fixering och inaktivering.

3. En lagom mängd fecesblandning (beroende på provets tjocklek) filtreras genom ett lager fuktad gasväv lagt över en plastbägare. OBS! Om provet är mycket tunt eller mest består av slem fortsätt direkt till punkt 7 (se även anmärkning 1).

4. Kontrollera om det finns maskar eller maskdelar i gasväven.

5. Häll över filtratet i ett märkt centrifugrör. Justera volymen med formalin till 7 mL.

6. Tillsätt 3 mL etylacetat och sätt på skruvlocket. Skaka 15 sek med skakapparat alternativt 30 sek för hand.

7. Centrifugera i minst 1000 x g under 1- 2 min. Behåll skruvlocket på. Centrifugera 5 min om Cryptosporidium-undersökning är begärd (se anmärkning 2).

8. Röret innehåller nu fyra skikt. I botten ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg och överst en etylacetatfas.

9. Lossa försiktigt fettpluggen med en träpinne och häll av allt utom sedimentet (som bör vara ganska litet, se anmärkning 4 nedan). Häll avfallet i lämpligt kärl.

10. Torka av insidan av röret med en bomullspinne.

11. Sätt vid behov till ett par droppar 0,9 % NaCl till bottensatsen.

12. Låt röret stå i dragskåp tills etylacetaten har avdunstat innan avläsning.

Anmärkning

1. Mycket tunna och/eller slemmiga prov tappar det mesta av sitt material vid ovanstående koncentrations-förfarande. Sådana prov centrifugeras direkt efter formalinfixering utan vare sig filtrering eller skakning med etylacetat.

2. Föreslagna centrifugeringstider och g-tal varierar mycket mellan olika publikationer. För koncentration av Cryptosporidium-oocystor rekommenderas längre centrifugeringstid (5-10 min) än för cystor och maskägg (1-2 min).

3. Om bottensatsen är för tjock – tag mindre mängd fecesblandning under punkt 3 ovan.

4. SAF-fixativ är ett transportmedium och enligt publicerade rekommendationer skall det filtrerade provet först tvättas med NaCl. För fortsatt koncentrering rekommenderas formalin eller NaCl (ref 4 och 5).

Avläsning

Blanda sedimentet. Märk ett objektglas med provnummer och lägg upp två preparat från varje prov. Om frågeställningen avser trematodägg granskas hela sedimentet. Det ena preparatet blandas med en droppe jodlösning innan täckglas läggs på. Granska systematiskt hela det ofärgade preparatet med 10x objektiv eller med högre förstoring om så behövs. Det jodfärgade preparatet granskas med 20x objektiv eller högre. Maskägg syns i regel bra med 10x objektiv och utan jodfärgning, medan cystor lättare upptäcks och identifieras vid högre förstoring och med jodfärgning. Använd mätokular när så erfordras. Cryptosporidium-oocystor kan ibland upptäckas vid direkt-mikroskopi av sediment från koncentrationsmetoden. För konfirmering krävs färgning med specifik metod. Se metodbeskrivning Ziehl-Neelsen färgning PAR 2. För morfologiska kriterier hänvisas till respektive parasitavsnitt.

Kvalitetssäkring

UK-NEQAS feces-utskick. För lämpligt bildmaterial se referens 6 och 7.

Referenser

1. D'Antoni, Joseph S. Standardization of the Iodine Stain for Wet Preparations of Intestinal Protozoa Am J Trop Med 1937, 1-17: 79-84.

2. Allen A V H, Ridley D D. Further observations on the formol-ether concentration technique for faecal parasites. J Clin Path 1970; 23:545-46.

3. Young K H, Bullock S L, Melvin D M, Sprull C L. Ethyl acetate as a substitute for diethyl ether in the Formalin-ether sedimentation technique. J Clin Microbiol 1979; 10:852-3.

4. Utzinger J, Botero-Kleiven S, Castelli F, Chiodini PL, Edwards H, Köhler N, Gulletta M, Lebbad M, Manser M, Matthys B, N'Goran EK, Tannich E, Vounatsou P, Marti H. Microscopic diagnosis of sodium acetate-acetic acid-formalin-fixed stool samples for helminths and intestinal protozoa: a comparison among European reference laboratories. Clin Microbiol Infect. 2010 Mar;16(3):267-73.

5. Yang J, Scholten T. A fixative for intestinal parasites permitting the use of concentration and permanent staining procedures. Am J Clin Pathol. 1977 Mar;67(3):300-4.

6. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 1-9.

7. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fifth edition, 2007.