PAR 01 Cystor och maskägg, feceskoncentration

Huvudartikel, publicerad februari 2012.

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik och Tarminfektioner

---

Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces

Analysprincip

Formalinfixerad feces filtreras, skakas med etylacetat och centrifugeras för att separera maskägg, larver, cystor och oocystor från fett och skräp. Efter centrifugering bildas fyra skikt: i botten av röret ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg med skräp och överst en etylacetatfas. Sedimentet granskas i ljusmikroskop. Materialet i sedimentet kan även användas till olika specialfärgningar för att identifiera specifika parasiter. Observera att metoden inte rekommenderas för påvisning av trofozoiter i feces, Screening av trofozoiter görs istället innan koncentrering, d .v. s. direkt efter filtrering. Trofozoit-screening förutsätter att provet består av SAF-fixerad feces. För verifierande färgningsmetod se metodbeskrivning PAR 03 .

Speciell utrustning

Ljusmikroskop objektiv 10x, 20/25x, 40x samt med kalibrerat mätkular

Reagenser

• formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin)
• etylacetat C₄H₈O₂ p.a.
• D'Antonis jodlösning (ref. 1)

Lös 1,0 g kaliumjodid och 1,5 g jodkristaller i 100 mL destillerat vatten.

Använd magnetomrörare. En del kristaller förblir olösta. Förvaras i mörk flaska. Filtreras innan användning.

• natriumklorid 0,9 %

Analysprocedur

1. Blanda en sked (ca 1 gram) feces med 7 mL 3,7 % formaldehyd i ett märkt rör. (Observera att detta moment redan är utfört på de prov som sänts in i formaldehyd eller SAF-fixativ (anmärkning 1). Blanda provet noggrant med ett par träpinnar.

2. Låt stå 30 min för fixering och inaktivering.

3. En lagom mängd fecesblandning (beroende på provets tjocklek) filtreras genom fuktad gasväv lagt över en plastbägare (anmärkning 2). OBS! Om provet är mycket tunt eller mest består av slem fortsätt direkt till punkt 7 (anmärkning 3).

4. Kontrollera om det finns maskar eller maskdelar i gasväven.

5. Häll över filtratet i ett märkt centrifugrör. Justera volymen med formalin till 7 mL.

6. Tillsätt 3 mL etylacetat och sätt på locket (skruvlock eller propp). Skaka 15 sek med skakapparat alternativt 30 sek för hand.

7. Centrifugera i minst 1000 x g under 2–3 min. Behåll locket på. Centrifugera 5 min om Cryptosporidium-undersökning är begärd (anmärkning 4).

8. Röret innehåller nu fyra skikt. I botten ett sediment, sedan en formalinfas, en fettplugg och överst en etylacetatfas.

9. Håll röret med botten snett uppåt och lossa försiktigt fettpluggen med en träpinne och häll av allt utom sedimentet (anmärkning 5). Häll avfallet i lämpligt kärl.

10. Behåll röret i samma position och torka av insidan med en bomullspinne. På detta sätt undviker man att få rester av etylacetat i sedimentet.

11. Sätt vid behov till ett par droppar 0,9 % NaCl till bottensatsen.

12. Låt röret stå i dragskåp tills etylacetaten har avdunstat innan avläsning.

Anmärkning

1. SAF-fixativ är ett transportmedium och enligt publicerade rekommendationer skall det filtrerade provet först tvättas med NaCl. För fortsatt koncentrering rekommenderas formalin eller NaCl (ref 4 och 5). 2. Ovanstående analysprocedur kan anpassas enligt lokala behov. T. ex kan gasväven läggas i en tratt och provet filtreras direkt i röret.

3. Mycket tunna och/eller slemmiga prov tappar det mesta av sitt material vid ovanstående koncentrations-förfarande. Sådana prov centrifugeras direkt efter formalinfixering utan vare sig filtrering eller skakning med etylacetat.

4. Föreslagna centrifugeringstider och g-tal varierar mycket mellan olika publikationer. För koncentration av Cryptosporidium-oocystor rekommenderas längre centrifugeringstid (5–10 min) än för cystor och maskägg (2–3 min).

5. Om bottensatsen är för tjock – tag mindre mängd fecesblandning under punkt 3 ovan.

Avläsning

Blanda sedimentet. Märk ett objektglas med provnummer och lägg upp två preparat från varje prov. OBS! Om frågeställningen avser trematodägg granskas hela sedimentet. Det ena preparatet blandas med en droppe jodlösning innan täckglas läggs på. Granska systematiskt hela det ofärgade preparatet med 10x objektiv eller med högre förstoring om så behövs. Det jodfärgade preparatet granskas med 20x objektiv eller högre. Maskägg syns i regel bra med 10x objektiv och utan jodfärgning, medan cystor lättare upptäcks och identifieras vid högre förstoring och med jodfärgning. Använd mätokular när så krävs. Cryptosporidium-oocystor kan ibland upptäckas vid direkt-mikroskopi av sediment från koncentrationsmetoden. För konfirmering krävs färgning med specifik metod. Se metodbeskrivning Ziehl-Neelsen färgning PAR 02. För morfologiska kriterier hänvisas till respektive parasitavsnitt.

Svarsrutiner

Negativa prov: Inga cystor eller maskägg påvisade

Positiva prov: Utsvar skall innehålla information om utvecklingsstadium och om möjligt både genus och species. Exempel positivt prov: Cystor av Giardia intestinalis påvisade

Kvalitetssäkring

Intern

En panel med prov innehållande alla vanligt förekommande fecesparasiter rekommenderas för intern kvalitetssäkring. För lämpligt bildmaterial se referens 6 och 7.

Extern

Cystor, oocystor och maskägg ingår i UK-NEQAS feces-utskick.

Referenser

1. D'Antoni, Joseph S. Standardization of the Iodine Stain for Wet Preparations of Intestinal Protozoa Am J Trop Med 1937, 1-17: 79-84.

2. Allen A V H, Ridley D D. Further observations on the formol-ether concentration technique for faecal parasites. J Clin Path 1970; 23:545-46.

3. Young K H, Bullock S L, Melvin D M, Sprull C L. Ethyl acetate as a substitute for diethyl ether in the Formalin-ether sedimentation technique. J Clin Microbiol 1979; 10:852-3.

4. Utzinger J, Botero-Kleiven S, Castelli F, Chiodini PL, Edwards H, Köhler N, Gulletta M, Lebbad M, Manser M, Matthys B, N'Goran EK, Tannich E, Vounatsou P, Marti H. Microscopic diagnosis of sodium acetate-acetic acid-formalin-fixed stool samples for helminths and intestinal protozoa: a comparison among European reference laboratories. Clin Microbiol Infect. 2010 Mar;16(3):267-73.

5. Yang J, Scholten T. A fixative for intestinal parasites permitting the use of concentration and permanent staining procedures. Am J Clin Pathol. 1977 Mar;67(3):300-4.

6. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 1-9

7. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.

---