PAR 05 Anrikning av Strongyloides-larver

PAR 05 Mikroskopisk påvisning av Strongyloides-larver efter anrikning på agar-platta Indikation Vid klinisk misstanke om Strongyloides-infektion när koncentrationsmetoden (PAR01) är negativ. Analysprincip Larver från färsk feces anrikas på agarplatta. Larverna lämnar karakteristiska spår på plattan och identifieras därefter till speciesnivå genom mikroskopering av avdödat material. OBS! Med denna anrikningsmetod kan eventuella hakmaskägg i provet kläckas och larver utvecklas. För att utesluta hakmask-infektion rekommenderas därför att även koncentrationsmetod för cystor och maskägg utförs på prov där Strongyloides-anrikning begärts (PAR01). Provtagning och transport 5–10 gram färsk feces rekommenderas. För optimalt utbyte bör feces tas om hand så snabbt som möjligt efter provtagning. Om provet skall sändas till annat laboratorium skall transporttiden inte överstiga 1 dygn. Feces skall förvaras i rumstemperatur i avvaktan på analys samt under transport då larvernas viabilitet påverkas av låg temperatur. Apparatur Inverterat mikroskop Material Parafilm Reagenser Agarplatta Agar 1,5 % Köttextrakt 0,5 % Pepton 1,0 % Na Cl 0,5 % Agarplatta med detta innehåll blir ganska genomskinlig, vilket underlättar senare avläsning. NaCl 0,9 % Formaldehyd 3,7 % Analysprocedur Iaktta försiktighet. Använda alltid handskar vid arbete med levande Strongyloides-larver 1. Rör ut cirka 3 gram färsk feces med fysiologisk NaCl så att konsistensen blir krämig. Feces med lös koncistens behöver inte tunnas ut ytterligare med NaCl. 2. Lägg materialet i mitten av agarplattan så att utbredningen blir ungefär som en enkrona. 3. Lägg på locket och förslut plattan med en remsa av parafilm. Förvara sedan i inkubator i 30 °C till 32 °C. Undvik direkt solljus. 4. Granska plattan dagligen i inverterat mikroskop för att se om larverna lämnat spår. Typiska spår för Strongyloides-larver finns avbildade i referens 1. 5. Om spår ses öppnas plattan försiktigt. Skölj försiktigt ytan med 3,7 % formaldehyd (10 % formalin). Låt stå 30 min för avdödning. Sug upp vätskan med en plastpasteur-pipett och överför till ett centrifugrör. 6. Centrifugera den uppsugna vätskan i 500 x g 5 minuter. 7. Om inga spår ses avslutas inkubationen efter 3 dagar. Skölj därefter plattan och fortsätt enligt punkt 5 och 6 ovan. Bedömning av sediment Häll av ovanvätskan och lägg upp ett preparat på objektglas. Kontrollera ”svanspartiet” i mikroskop med objektiv 40x. Filariforma larver av Strongyloides stercoralis har kluven svans i motsats till filariforma larver av hakmask. Fortsätt att lägga upp av materialet tills hela sedimentet är granskat För mer specifik artbestämning och differentiering från hakmasklarver se referens 1 och 2 samt under sektion Strongyloides stercoralis. Hakmask-larver (som kläcks från ägg i provet) kan ses redan första dagen men största antalet kommer först efter 5 dagar (när inkubationen redan är avslutad). Dessa larver lämnar annorlunda spår. Säkerhetsaspekter OBS! Iaktta stor försiktighet vid hantering av plattor med anrikat material. Anrikningsmetoden leder till att infektiösa, filariforma larver av Strongyloides utvecklas. Utsvar: Positivt prov: Rhabditiforma/filariforma larver av Strongyloides stercoralis påvisade Negativt prov: Inga larver påvisade Anmärkning Vid stark klinisk misstanke om Strongyloides-infektion och negativ isolering, exempelvis oklar eosinofili hos patient som varit i endemiskt område, rekommenderas att analysen upprepas på nytt prov. Denna metod kan även användas för anrikning av hakmasklarver. Inkubering och daglig granskning skall då pågå under minst en vecka. Kvalitetssäkring Avdödade larver av Strongyloides stercoralis ingår i UK-NEQAS feces-utskick. Prestanda Metoden har högre känslighet än koncentrationsmetoden (cystor och maskägg) och rekommenderas vid låg utsöndring av larver. Referenser 1. Ines Ede J, Souza JN, Santos RC, Souza ES, Santos FL, Silva ML, Silva MP,Teixeira MC, Soares NM. Efficacy of parasitological methods for the diagnosis of Strongyloides stercoralis and hookworm in faecal specimens. Acta Trop. 2011 Dec;120(3):206-10. 2 Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago 3 Garcia LS. Diagnostic Medical Parasitology, fifth edition, ASM Press, Washington D.C.