PCR-baserade metoder, allmänt
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
PCR-baserade metoder
Allmänt
PCR är en förkortning av det engelska uttrycket ”polymerase chain reaction” och innebär mångfaldigande och påvisande av känd nukleinsyra (DNA eller RNA) -sekvens. Kary B. Mullis, fick i mitten av 1980-talet idén till tekniken som sedan utvecklats och förfinats på en mängd olika sätt. Idén belönades med Nobelpris 1993.
Huvudingredienserna för detektion av DNA med PCR-teknik är: DNA-polymeras, primrar, fria nukleotider (dNTP) och templat (mål-DNA) som skall påvisas. Den inbördes koncentrationen av dessa måste optimeras för varje PCR. Därtill kommer väl avvägd Mg2+ eller i vissa fall Mn2+ koncentration, och en buffert för att ge optimal aktivitet hos polymeraset.
DNA-polymeras katalyserar polymerisering av nukleinsyra, i 5’-3’ riktning (figur 8). Med hjälp av byggstenarna dNTP tillverkas dubbelsträngat DNA med enkelsträngat templat-DNA som mall. Man använde tidigt DNA-polymeras från en bakterie, Thermus aquaticus, som har ett värmestabilt polymeras. Därav kommer namnet Taq-polymeras. Polymeraset har modifierats och finns nu i ett flertal varianter med aktivitet och sensitivitet anpassad för många olika applikationer. Några exempel på olika DNA-polymeras:
- som modifierats och måste aktiveras genom upphettning vid 95°C i omkring 10 min innan full aktivitet erhålls vilket ökar reaktionens sensitivitet och specificitet.
- som lämpligen används då extra långa nukleinsyrasekvenser skall syntetiseras.
- lämpliga att använda då syntetiserat DNA skall användas för kloning, på något sätt märkas eller användas för sekvensering.
- att använda då extra snabbt DNA-polymeras är till nytta.
- som kan användas då särskilt hög noggrannhet krävs.
- lämpliga att använda vid polymerisering av målsekvens med extra högt innehåll av kvävebaserna guanin och cytosin.
Figur 8. Principskiss av PCR dvs mångfaldigande av nukleinsyra. Vid varje cykel fördubblas antalet av de DNA-molekyler som primrarna kan baspara till. Bild; Christina Welinder-Olsson
Primrarna som skall detektera sökt målsekvens måste designas så att de förutom att hybridisera (baspara till målsekvensen) i möjligaste mån inte hybridiserar till varandra och bildar så kallade ”primer-dimer”. Det är också viktigt att de har samma Tm (har samma smältpunkt) och därmed kan användas vid samma annealing temperatur under PCR-reaktionen. Detta erhålls bla genom att de har ungefär samma längd, ca 20 bp, och liknande guanin-cytosin innehåll. Det finns dataprogram för primerdesign att ladda ner från internet och det finns också mjukvara att köpa för detta ändamål.
dNTP är de fria nukleotiderna dATP, dTTP, dCTP och dGTP som är byggstenar i nukleinsyran och som DNA-polymeraset använder för att polymerisera/bygga en ny DNA-sträng med enkelsträngat DNA som mall.
Konventionell PCR
För att påvisa amplifierad nukleinsyra användes inledningsvis agarosgelelektrofores för separation av nukleinsyran och infärgning av densamma med etidiumbromid som syns och kan fotograferas vid belysning med UV-ljus. Detta sätt att detektera nukleinsyran omnämns ofta som konventionell PCR och används visserligen 2010 fortfarande, men realtids-PCR (beskrivs nedan) blir allt vanligare.
RT-PCR står för reversed transkriptase PCR. Tekniken används när templatet är RNA, till exempel när viral arvsmassa, som ofta är RNA, ska detekteras och analyseras. PCR-analysen inleds då med ett enzym som katalyserar polymerisering av fria nukleotider (dNTP) till dubbelsträngat DNA, med templat-RNA som mall. Enzymet är ofta en i E. coli klonad gen som kodar för Moloney Murine Leukemia Virus reverse transkriptase.
Nestad PCR är i princip detsamma som en dubbel PCR. Efter en inledande PCR används en del av det amplifierade materialet som mall för ytterligare en PCR. Ett nytt primerpar, som basparar till ett område innanför det område som detekterats av PCR nummer ett, används för denna andra PCR-reaktion. Detta är ett sätt att höja både sensitivitet och specificitet.
Multiplex PCR innebär samtidig detektion av flera olika målsekvenser, dvs flera primerpar som basparar till olika agens eller templat används samtidigt i samma reaktion. Detta innebär alltså en samtidig detektion av flera agens eller målsekvenser i ett rör. Tyvärr sänks ofta sensitiviteten något vid denna typ av analys och höga krav ställs på primrarnas utformning.