Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker
Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
och
falldefinitionen [[]]
Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker
Bakgrund
Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoder för epidemiologisk som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men används idag som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.
Mellan åren 2000 till 2006 typades vid SMI alla insända isolat av MRSA med PFGE och en nationell databas byggdes upp. Sedermera har man övergått att utföra så kallad spa-typning för epidemiologisk typning av MRSA. I vissa sammanhang, framför allt i samband med internationella jämförelser av isolat, både inom och utom Europa, kan även en annan typningsmetod, så kallad multi locus secquence typing, (MLST), användas.
Nedan beskrivs som exempel på PFGE-analys en klassisk metod för MRSA.
PFGE baserar sig på att med restriktionsenzymer klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten med elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. För varje bakterieart måste metoden optimeras. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används restriktionsenzymet SmaI. Efter avslutad elektrofores färgas gelen för att visualisera banden av DNA-fragment av olika storlek (PFGE-mönster) och avfotograferas. Resultatet databehandlas för att identifiera likheter och olikheter mellan isolaten. Bakterieisolat av samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.
Indikation
För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra bakterieisolat.
Provmaterial
Renkultur av stafylocker på agarplatta.
Analysprincip
Att extrahera bakteriernas DNA och med restriktionsenzym klyva detta till mindre fragment. DNA-fragmenten separeras efter storlek i agarosgel och ger för stammen ett unikt bandmönster.
Apparatur Termostat 37 och 55°C Centrifug ≤ 12.000 x g Pipett 1-10 µl Pipett 1-40 µl Pipett 40-200 µl Pipett 200-1000 µl Elektroforesutrustning för PFGE UV-bord med kamera Våg 300/3000 g Våg 1 mg- 160 g
Förbrukningsmateriel och reagens Ref stam NCTC 8325 McFarlandrör nr 4 13 ml polypropylenrör Engångsplatinös 1,5 ml centrifugrör Engångstippar till ovanstående pipetter Skalpell Spatlar Petriskål Gjutformar till agarospluggar Dubbeldetsillerat DNAse och RNAse fritt vatten 1M Tris HCl pH 7,5 5 M NaCl 0,5 M EDTA pH 8,0 LMT agaros (2% I EC buffert) FMC Bioproducts Lysostaphin 1 mg/ml i 0,05 M Tris HCl (pH 7,5) 0,15 M NaCl Proteinase K (5mg/ml I d.d. sterilt vatten)
TEN-buffert: 100 mM Tris HCl pH 7,5
100 mM EDTA
150 mM NaCl
EC-buffert: Trizma Hydroklorid 0,95 g
NaCl 58,4g
Etylendiamintetraättiksyra 29,2 g Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter 5 g N-Lauryl-sarcosin 5 g Natriumdeoxycholat 2 g Dest vatten ca 800 ml Ph justeras med ca 50 ml 5 M NaOH till 7,5
TE-buffert: 10 mM Tris HCl pH 7,6 1mM EDTA
10x TBE buffert:
Trizma base 108 g
Borsyra H3BO3 55,65 g
Titriplex III (Na-EDTA) 7,44 g
Dest vatten till 1000 ml
Ultra pure TM agarose Invitrogen Restriktionsenzym Sma 1 med buffert Gel Red
Analyspocedur
DNA extraktion
Över natt kultur bakterier på agarplatta slammas i 500 µl TEN-buffert till täthet 1x 109 bakt/ml i centrifugrör, centrifugeras 10 sek x 7000 x g, dekanteras och resuspenderas i 125 µl EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min.Tillsätt 125 µl 55°C 2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert. Tillsätt 12 µl 1 mg/ml lysostaphin, blanda väl genom att pipettera upp o ner några gånger och gjut agarosen i pluggformar med hjälp av pipett.Låt pluggarna stelna i +4°C 10-15 min.Placera pluggarna från respektive isolat i ett centrifugrör. Oftast gjuts två pluggar /isolat, med 1 ml EC-buffert och inkubera i 37°C.Dela en av pluggarna med skalpell i tre delar. Två av bitarna överförs till nytt rör och 250 µl TE-buffert samt 25 µl proteinase K (5 mg/ml) tillsätts. Inkubera 1 timma 55°C.Avlägsna bufferten och tillsätt ny kylskåpskall TE-buffert och detta upprepas 4-5 ggr med 10 min mellanrum. Förvara pluggarna i kyl mellan tvättarna. Pluggarna kan sparas i kyl i 4 °C någon vecka.
Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1
1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat). 2. Tillsätt 100 μl av ovanstående buffert till varje centrifugrör. 3. Tillsätt 1 μl enzym (= 1Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt. 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret. 5. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter vid 37°C. 6. De digererade pluggarana kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 ml 0,5 x TBE-buffert 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim. 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen. Om gel med 15 brunnar används placeras klyvningar från referensstammen lämpligen i brunn nr 2, 8 och 14.
4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 l vatten.) 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta. 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C. 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp. 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.