Salmonella

Huvudartikel: Referensmetodik: Tarmkanalens infektioner, 2:a upplagan 2002

Smittämnet

Genus Salmonella utgörs av gramnegativa stavar tillhörande familjen Enterobacteriaceae. Enligt den nomenklatur som rekommenderas av WHO och används i Sverige indelas Salmonella efter DNA/DNA homologi i två arter, Salmonella enterica och Salmonella bongori (tidigare subspecies V). Salmonella enterica kan vidare biokemiskt indelas i sex subspecies som kan åtskiljas biokemiskt:

I S. enterica subsp. enterica
IIS. enterica subsp. salamae
IIIa S. enterica subsp. arizonae
IIIb S. enterica subsp. diarizonae
IV S. enterica subsp. houtenae
VI S. enterica subsp. indica

Tabell 7. Biokemiska test för särskiljande av subspecies

Malonat ONPG Dulcit Salicin GalUA1 Gelatin I - - + - - - II + - + - + + III + + - - +/- + IV - - - + + + VI - v v - + + S. bongori - + + - + - ¬¬¬¬ ¬¬ 1) Galakturonsyra Baserat på förekomsten av två ytstrukturer, lipopolysackarid (O-antigen) och flageller (H-antigen) kan Salmonella enligt det senaste KW-schemat, 2001, indelas i 2501 serotyper. Vissa serotyper, främst Salmonella Typhi, kan även ha ett kapselliknande Vi-antigen. Flertalet serotyper producerar två olika typer av flageller. Under många år har de olika serotyperna av Salmonella givits ett namn, oftast beskrivande isolatets geografiska härkomst. Då dessa namn sedan länge är eta¬blerade både bland mikrobiologer och i det epidemiologiska arbetet accepteras de fortfarande. De är ej artnamn och skall därför inte kursiveras men skrivas med stor bokstav, t.ex. Salmonella Enteritidis. Den korrekta nomenklaturen, Salmonella enterica subsp. enterica serovariant Enteritidis, används inte i det praktiska arbetet. Serotyper tillhörande subspecies II – VI samt Salmonella bongori ges ej namn utan de beskrivs enbart genom sin antigena formel t.ex. Salmonella subsp IV = 45:g,z51:- som betyder att stammen tillhör subspecies IV och där ”45”: anger O-antigenet, ”g,z51” anger H-antigen fas 1 samt att ”-” anger att H-antigen fas 2 saknas. Nya serotyper definieras och fastställs vid WHO collaborating centre for Refe¬rence and Research on Salmonella vid Institut Pasteur i Paris.

Patogenes och patofysiologi

Infektionsdosen för friska personer med intakt immunsystem uppskattas till 106-108 bakterier, dock väsentligt lägre för S. Typhi och S. Paratyphi A (ca 103 bakte¬rier, vilket ökar risken för person till person smitta). Infektionsdosen är lägre vid immunbristtillstånd. Reducerad saltsyresekretion i magsäcken ger också ökad mottaglighet. Bakterierna invaderar tarmslemhinnans epitelceller och multiplice¬ras i dessa liksom i makrofager. Skadorna är emellertid sällan så omfattande som vid Shigella-infektion.

Symtom och klinisk bild

Salmonella-infektioner kan ge upphov till olika sjukdomsbilder. Vanligast är enterit, som kan förorsakas av alla salmonellatyper. Mer sällan ses en kolitbild med blodig avföring. Symtomen är illamående, kräkningar, huvudvärk, buk¬smärtor och diarré. Måttlig feber kan förekomma och ibland föreligger bakte¬riemi eller bakteriuri. Symtomen vid salmonellaenterit utvecklas som regel inom ett till tre dygn efter smittillfället. Sjukdomen är som regel självbegränsande (7 till 10 dagar) hos immunkompetenta personer. Efter invasion av blodbanan ses inte sällan fokala manifestationer. Alla organ kan drabbas. En reaktiv artrit ses i ett par procent av fallen. Fecesodlingar kan vara positiva i upp till 3 månader. Asymtomatiska infektioner är inte ovanliga. Majoriteten av de humana salmo¬nellainfektionerna orsakas av bakterier tillhörande subspecies I.

S. Typhi och S. Paratyphi A ger ofta svårare septiska tillstånd ibland med ce¬rebral påverkan. Diarré förekommer men en del patienter är snarare förstoppade. Fruktade komplikationer är tarmperforation och blödning vilka dock sällan ses i Sverige. Kroniskt bärarskap, definierat som positiva fecesodlingar > 6 månader, är sär¬skilt vanligt efter tyfoidfeber (ca 3 %) men förekommer vid alla typer av salmo¬nellainfektion. Framför allt utgör gallvägar och tarmdivertiklar reservoar för bakterierna. Omkring 50 % av vuxna med salmonellaenterit är ”smittfria” efter fyra till fem veckor. Laboratoriediagnostik Allmänt Vid septiska tillstånd bör blododling utföras. När det gäller primärisolering av Salmonella-bakterier från feces finns det vissa brister i diagnostiken som fram¬går av avsnittet Kvalitetssäkring. Säkerhetsaspekter Observera att Salmonella Typhi sedan den 31 mars 1998 klassas som Biosafety level (BSL) 3** patogen (se vidare detta avsnitt).Vid misstanke om S. Typhi är det viktigt att detta anges på remissen. Misstänkt S. Typhi är en stam som jäser mannit utan gas-utveckling och som är OD-negativ. Referensmetodik Referenssubstrat Nedanstående substrat utgör referenssubstrat vid primärisolering av Salmonella-bakterier från humana fecesprov (se Bilaga 1.1 substratbeskrivningar). Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se bilaga 1.2 - substratkontroll. XLD-agar [Bilaga 1.1.1]: På XLD-agar växer Salmonella-bakterier inom ett dygn som regel med ett growth index (GI) jämfört mot blod eller CLED-agar över¬stigande 50 %. DC-agar [Bilaga 1.1.2]: Den något mer selektiva Hynes´ modifikation utgör refe¬renssubstrat. På DC-agar växer Salmonella-bakterier inom två dygn med GI överstigande 50 % jämfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall. MacConkey-agar [Bil 1.1.15]: Salmonella-bakterier växer inom ett dygn med GI överstigande 80 % jämfört med icke selektivt substrat i de allra flesta fall (un¬dantag t.ex. S. Senftenberg CCUG 37886). Kolonierna är därvid konvexa, se¬miopaka, blanka, ibland råa och färglösa. Kolonidiametern motsvarar den för DC-Hynes. Inku¬beras i 35 °C – 37 °C i ett dygn. För anrikning är Rappaportbuljong [Bil 1.1.4] referenssubstrat lämpad för alla typer av Salmonella (ej S. Typhi) med inkubering vid 41,5 °C + 0,5 °C. Isolering Primär odling: Salmonella-bakterier tillväxer både aerobt och anaerobt inom ett brett temperaturområde, +8 C – 45 C men optimalt vid 37 C, och inom ett pH-intervall 4-8. Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinne stryks ut på XLD-agar och DC-agar varefter sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 C – 37 C. XLD-plattan avläses efter 1 dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn. Anrikning och sekundär utodling: Efter det primära utstryket stoppas provtag¬ningspinnen ner i Rappaportbuljong och inkuberas i 41,5 °C + 0,5 °C över natt. Med plastinös görs därefter utstryk och sekundärstryk på XLD-agar. Plattan inkuberas vid 35 C - 37 C över natt och avläses. Identifiering och minimikriterier Presumtiv diagnos: På XLD-agar är kolonierna semiopaka, släta, blanka och färglösa (framstår röda mot mediets grundfärg). Kolonierna är ofta stora med diameter >2 mm och ett distinkt svart centrum. Observera att atypiska LD-nega¬tiva och/eller laktosjäsande Salmonella, i likhet med andra koliforma bakterier, kan växa med gulfärgade, opaka kolonier. Observera att S. Typhi sällan blir H2S-positiv på XLD. Inkuberas i 35 °C - 37 °C och avläses efter ett dygn. På DC-agar är kolonierna semiopaka, blanka, färglösa, och i mer än hälften av fallen med grått eller svart centrum. De flesta stammar växer ut redan inom ett dygn. Kolonidiametern är ofta mindre än motsvarande på XLD. Inkuberas i 35 °C – 37 °C och avläses efter ett och två dygn. Slutlig diagnos: Misstänkta kolonier plockas och karakteriseras med testbatteri (enligt Tabell 8) som inkuberas över natten i 35 °C – 37 C. Om biokemin är ty¬pisk enligt rad 1 är ingen ytterligare diagnostik nödvändig. Isolatet anses identi¬fierat som Salmonella species. Vid biokemiskt utfall enligt rad 2 - 4 måste kompletterande test med agglutina¬tion i polyvalent O-serum utföras. Ungefär 95 % av kliniska isolat agglutinerar i poly O. Korsreaktivitet med andra species inom Enterobacteriaceae t.ex. E. coli kan förekomma. Kompletteringstestet skall vara positivt. Tillsammans med något av de biokemiska utfallen i Tabell 8 rad 2 - 4 anses isolatet identifierat som Salmonella species. Tabell 8. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat vid identifiering av Salmo¬nella-bakterier Typiskt för Mannit LD OD3) H2S ONPG Indol Urea S. ssp. +/gas1) +2) + + - - - I,II,IV,VI

S. Typhi +/0gas + - + - - - S. Para- +/gas - + - - - - typhi A

S. ssp. III/ 	+/gas	  +	  +	   +	    + 	   - 	   -  S. bongori				 	_______¬_________                                                                                                                             1)c:a 4 % jäser utan gasutveckling.   2) c:a 2 % LD-negativa.  3) OD ingår ej i minimikriterierna men rekommenderas som tillägg då S. Typhi misstänks. 
Om kompletteringstestet utfaller negativt eller om biokemin inte är konklusiv görs komplettering med kommersiell analysbricka, t.ex. API 20E (Bio Merieux, Frankrike). Kvarstår misstanke om Salmonella species skickas isolatet till SMI för verifiering.

Avvikelser från referensmetodiken Referensmetodiken anger en miniminivå för diagnostiken. Vissa avvikelser kan dock vara acceptabla. Substrat: Vid primärisolering kan ett av de selektiva referensagarmedierna er¬sättas av ytterligare en anrikningsbuljong (Rappaport i kombination med Sele¬nit).Selenit-buljong [Bilaga 1.1.4] (laktosbaserad) är lämpad för anrikning av alla typer av Salmonella species direkt i fecesprov vid en inkuberingstemperatur av 35 °C (ibland anges 42 °C som lämplig inkuberingstemperatur även för Sele¬nit-buljong). XLD-agar kan bytas mot t.ex. Hektoen-agar [Bilaga 1.1.3]. SSI-Enteric medium [Bilaga 1.1.7] kan också vara ett alternativ men svenska erfa¬renheter är begränsade.

Kompletterande test: Som kompletterande test kan någon av nedanstående er¬sätta agglutination i polyvalent serum:

A) Salmonella-fag: (Reagensia AB) Majoriteten av alla kliniska isolat av Salmonella (ca 95 %) är känsliga för bakte¬riofag Felix O-1 (FO). Denna test är därför ett bra komplement till den bioke¬miska identifieringen. Bland andra enterobakterier är det främst E. coli som kan vara känslig. Av praktiska skäl är det lämpligt att redan i samband med ren¬spridning på MacConkey-plattan applicera en droppe fag på primärstryket.

B) MUCAP-test: (Svenska Labfab AB) Salmonella verkar vara unik inom Enterobacteriaceae genom att ha ett C8-este¬ras som hyd¬rolyserar metyl-umbelliferyl-caprilat. Fritt metyl-umbelliferyl fluo¬rescerar i UV-ljus. Testen genomförs så att en droppe av reagensen appliceras på bakterierna på en utvuxen agarkultur, t.ex. MacConkey. Fluorescens avläses i relativt mörker inom fem minuter. Som UV-källa kan ofta användas en UV-lampa av sådan typ som används för kontroll av sedlar (referensfrekvens Woods light = 366 nm). När detta reagens testades på 750 isolat av Salmonella var 749 positiva i testen. Av 130 andra enterobakterier var endast en stam av Hafnia alvei positiv. Många oxidaspositiva bakterier som Pseudomonas species och liknande bakterier kan ge positivt testresultat, medan negativt test kan före¬komma hos laktospositiva Salmonella-isolat.

Alternativ diagnostik

Ingen kommersiell snabbdiagnostik finns idag tillgänglig för humana fecesprov. På veterinär- och livsmedelssidan förekommer de dock.

Serologi

Vissa laboratorier påvisar förekomst av IgG och IgM antikroppar med en LPS-ELISA som detekterar antikroppar mot faktorerna O4 och O9. Denna serologi kan i vissa fall användas för diagnostik av Salmonella-infektion. Den klassiska Widal testen, påvisande av antikroppar mot Salmonella Typhi med av¬dödade bakterier som antigen, torde inte fylla någon plats i modern infektionsdiagnostik.

Epidemiologisk typning

Stam som av insändaren identifierats som Salmonella species sänds till SMI för epidemiologisk typning. Undantag är klara utbrott eller epidemier där endast ett representativt urval av stammar sänds. Hos känd smittbärare skall ej konsekutiva isolat sändas för typning. Avsikten med typning är att följa smittspridning, främst inom landet. I de fall laboratoriet känner till smittort är det av epidemio¬logiska skäl därför mycket viktigt att detta anges då det påskyndar den epidemi¬ologiska handläggningen, speciellt vid utbrott.

Typning görs idag primärt med serologisk teknik. Fullständig typning görs vid Smittskyddsinstitutet (SMI) och för veterinära isolat vid Statens Veterinärme¬dicinska Anstalt (SVA).

Motiverar smittspårningsarbetet ytterligare differentiering kan fagtypning och molekylärgenetisk metodik användas. Fagtypning av S. Typhimurium och S. Enteritidis utförs vid SMI. Även resistensmönstret är ofta till hjälp vid uppfölj¬ning av utbrott.

Kvalitetskontroll

Metodkalibrering förväntas ske på sätt som anges under avsnittet kvalitets¬säk¬ring i den allmänna delen.

Referensstammar

I tabell 9 listas de stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnos¬tiska procedurer:

Tabell 9. Referensstammar Salmonella för kontroll av substrat och övriga diag¬nostiska procedurer

	     		               	         Växt på 1)

Bakterie CCUG ATCC Karakteristika XLD DC Hynes S. Montevideo 21 239 Normalvariant >75 >50 S. Typhimurium 31 969 14 028 Normalvariant >75 >50 S. subsp. III 6 322 13 314 ONPG positiv 100 >75

   					Fag-negativ

S. Typhimurium 41 768 Jäser mannit utan gas >50 >25 S. Senftenberg2) 37 886 H2S-negativ, dålig växt <50 <1

1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s. antal CFU på testagar x100/ antal CFU på kontrollagar (CLED eller MacConkey), se bi¬laga 1.2 substratprövning.
2) Denna stam växer på Hektoen-agar med rGI >75 %

För de laboratorier som önskar serotypa Salmonella-isolat rekommenderas föl¬jande referensstammar

O4 -S. Typhimurium CCUG 31 969 O7 -S. Virchow CCUG 12 653 O8 -S. Newport CCUG 21283 O9 -S. Enteritidis CCUG 34136 O10 –S. Anatum CCUG 37885 O19 –S. Senftenberg CCUG 37 886

Referenssera

Polyvalent O-antiserum (Reagensia AB) Polyvalent H-antiserum (Reagensia AB) Faktorantiserum (Reagensia AB)

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets traditioner. Följande bör därvid iakttas: Vid premiärisolering anges fynd av Salmonella species och att isolatet sänds till SMI för epidemiologisk typning (se nedan). Efter erhållet typningssvar meddelas detta till inremitterande med angivelse av serotypnamn. Ev. fagtyp behöver däremot inte anges. Vid senare positiva kontrollodlingar räcker det att svara växt av Salmonella-bakterier (utan angivande av serotypnamn). Resistensmönster anges endast på begäran från kliniken.

Laboratorierapportering

Alla fynd av Salmonella skall anmälas av laboratoriet enligt smittskyddslagen Grupp 1.2 Samhällsfarliga sjukdomar, på därför avsedd blankett, eller via SMI¬net.

REFERENSER

Blaser MJ, Newman LS. A review of human salmonellosis. I. Infective dose. Rev Infect Dis 1982;4:1096-1106.

Smittsamma sjukdomar 2001. Epidemiologiska enhetens årsrapport. (http://www.smittskyddsinstitutet.se)

Gilligan PH, Janda JH, Karmali MA, Miller JM. Laboratory diagnosis of bacterial diar¬rhea. Cumitech 12 A. American Society for Microbiology, Washington DC, April 1992.

Infektionsmedicin. red Iwarson-Norrby. 1995. Säwe Förlag

Lindberg A, Andersson Y, Engvall A, Hjalt C-Å, Stenson H, Svenungsson B. Salmo¬nella, Strategidokument 1999. Socialstyrelsen, Artikelnr 1999-00-066.

Ljungh Å. Bacterial infections of the small intestine and colon. Current Opinion in Gas¬troenterology. 1998;14:33-44.

Popoff M. (1997) Antigenic formulas of the Salmonella serovars. Institut Pas¬teur. (KW-schemat). Kopior kan rekvireras från SMI.

RAF (www.srga.org)

Thore M, Lindman R. Primär diagnostik av Salmonella, Shigella och Yersinia. – Egen¬skaper hos olika fasta substrat, substrattesting, referensstammar, resultat av SMI-utskick 1998. SMI-tryck nr 127-1999

Wollin et al. Identification of Salmonellae with the 4-Methylumbelliferyl Ca¬prilate Fluo¬rescence test. J Clin Microbiol 1991;29:2631.