Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis-laboratoriediagnostik

Huvudartikel: Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

Laboratoriediagnostik

Allmänt

Alla arter av Yersinia (med undantag av Y. pestis) tillhör skyddsklass 2.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Nedanstående substrat utgör referenssubstrat vid primärisolering av Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis från humana fecesprov (recepten återfinns i bilaga 1.1)

• Yersinia selective agarbas enligt Schiemann (CIN-agar) [Bilaga 1.1.5]: Jämfört med icke inhibitoriskt kontrollsubstrat växer de flesta stammarna med GI >50 %. Många stammar av Y. pseudotuberculosis växer inom två dygn med samma koloniutseende som Y. enterocolitica.

• På XLD- eller Hektoen-agar kan Yersinia-bakterier också växa, men växer då med kolonier av samma utseende som övriga koliforma bakterier. På DC-agar kan Y. enterocolitica växa med typiska små ”gnistrande” kolonier.

Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se bilaga 1.2 substratkontroll.

Isolering

• Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinne stryks ut på CIN-agar och sekundärstryk görs. Plattan inkuberas i 28 °C - 30 °C i ett och två dygn.

• Anrikning: se under avsnittet avvikelser från referensmetodiken.

Identifiering och minimikriterier

• Presumtiv diagnos: Typiskt koloniutseende för Y. enterocolitica är små, centralt mörkröda och i periferin färglösa kolonier, som växer ut inom ett dygn s.k. "bull’s eye". Efter två dygn kan utseendet vara mer svårtolkat. Y. pseudotuberculosis har ett likartat utseende på CIN-agar, men i de fall bakterierna växer ut sker detta ofta först efter två dygns inkubering.

• Slutlig diagnos: En säker identifiering av en invasiv Yersinia med potential att orsaka yersinos kräver förutom en omfattande biokemisk testpanel även att stammen agglutinerar i antiserum samt att virulensplasmiden påvisas. Referensmetod för hur detta skall göras beskrivs nedan. En tränad bakteriolog kan dock med stor säkerhet komma till korrekt diagnos med betydligt enklare testbatteri (se avvikelser från referensmetoden).

• Misstänkta kolonier plockas och karakteriseras med biokemiskt testbatteri samt renstryks på MacConkey-agar (inkuberas i rumstemperatur, d.v.s. 28 °C - 30 °C, över natt). Resultatet av biokemisk testning avläses och tolkas enligt tabell 12.

Tabell 12. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 28 °C -30 C vid identifiering av Yersinia-bakterier (1)

Typiskt för	Mannit	LD	OD	H2S	ONPG	Indol	Urea
Y. enterocolitica O3/O9	+/0 gas	-	+	-	+	-	+
Y. enterocolitica O8/O9	+/0 gas	-	+	-	+	+	+
Y. pseudotuberculosis	+/0 gas	-	-	-	+	-	+

(1) Observera att ovanstående biokemiska utfall ej säkert identifierar humanpatogena Yersinia-bakterier. Kompletterande tester måste därför utföras (se text).

Om misstanke på Yersinia kvarstår efter utfall enligt tabell 12 utförs agglutina-tionstest i serogrupp-specifikt (O3 och O9) antiserum med bakterier utväxta på MacConkey-agar inkuberad i 28 °C - 30 C.

Observera att inget O-antigen produceras vid 37 C. Inte heller VP-reaktionen är positiv vid 37 C.

Oavsett resultatet av agglutinationstestet skall ytterligare identifiering ske med kommersiell analys¬bricka (t.ex. API 20E), vilken inkuberas enligt tillverkarens rekommendationer.

Den kommersiella testbrickan skall kompletteras med test för eskulinhydrolys (om sådan saknas i brickan) t.ex. med ROSCO-tabletter.

Patogena stammar av Y. enterocolitica, oberoende av serogrupp, är eskulin- och pyrazinamidasnegativa. Notera att Y. pseudotuberculosis är positiv i eskulin.

I tabell 13 sammanfattas olika utfall av referenstesterna och i tabell 14 anges ytterligare kriterier (ej minimikriterier).

Tabell 13. Utfall av referenstester för diagnostik av humanpatogena Yersinia-bakterier, samt tolkning av resultatet

---

Biokemiskt testbatteri indikerar	Kommersiell analysbricka	Eskulin-hydrolys	Aggl (O3/O9)	Tolkning
Y. enterocolitica	+	-	+	Y. enterocolitica O3 resp. O9
Y. enterocolitica	+	-	-	"annan humanpatogen serogrupp eller ej humanpatogen Yersinia, - Reflab
Y. enterocolitica	+	+	-	ej humanpatogen Yersinia
Y. enterocolitica	+ (-)	+/-	+	oklart, -Reflab
Y. pseudotuberculosis	+	+	-	Y. pseudotuberculosis *
Y. pseudotuberculosis	+	-	-	oklart, -Reflab
Y. pseudotuberculosis	-	+/-	-	ej humanpatogen Yersinia

-* SMI tar gärna emot positiva isolat då de är så ovanliga

• Slutlig identifiering: I tabell 14 anges ytterligare diagnostiska kriterier för yersinosframkallande organismer. Oklara fall enligt Tabell 13 vilka kan sändas till Referenslaboratorium testas där med detta batteri. Testerna kan givetvis också utföras på de enskilda laboratorierna.

Tabell 14. Identifiering av agens motsvarande smittskyddslagens yersinos

	VP, 22 C	VP, 37 C	Rhamnos	Salicin	Melibios	Sackaros	AA* 22 C	AA 37 C	Pyz**	Oxidas
YE O3	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-
YE O9	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-
YE 5/27 mm	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-
Y. pseudo	-	-	+	+/-	+	-	-	+		-

-* Autoagglutination, kan ersättas av specifik PCR -**Pyrazin amidas-test

Avvikelser från referensmetodiken

Referensmetodiken anger en hög ambitionsnivå för diagnostik av patogena Yersinia. I det praktiska arbetet på ett rutinlaboratorium kan diagnosen Yersinia enterocolitica O3 och O9, av en tränad bakteriolog, oftast ställas med betydligt färre biokemiska tester och utan att påvisa virulensplasmiden. Viktigt är då att man har gjort en jämförande studie som visar att de förenklingar som gjorts inte negativt påverkar specificiteten av diagnostiken.

Kommersiell selektiv peptonbuljong (t.ex. Yersinia selective enrichment broth acc. to Ossmer) kan användas för anrikning, men uppgift saknas över metodens effektivitet. Det är också acceptabelt att använda selektivt Yersinia agarsubstrat enligt Wauters [Bil. 1.1.6]. För primärisolering av Yersinia pseudotuberculosis kan MacConkey-agar utgöra ett komplement. Autoagglutination kan ersättas med specifik och utvärderad molekylärgenetisk metod (t.ex. PCR) för att påvisa virulensplasmiden. Odling i 22 °C och 28 °C-30 °C kan normalt ersättas med odling i rumstemperatur.

Alternativ diagnostik

Ingen alternativ diagnostik finns för närvarande tillgänglig för humana feces-prov. Diagnosen Yersina-infektion kan efter en infektion med serotyp O3 även ställas med serologi. Känsligast är en ELISA baserad på lipopolysackarid vilken används vid vissa laboratorier. Serologiska tester som använder avdödade bakte¬rier som antigen finns också.

Epidemiologisk typning

Utöver serotypning saknas etablerad metodik för epidemiologisk typning.

Kvalitetskontroll

Metodkalibrering förväntas ske efter de principer som skisseras under avsnittet kvalitetssäkring i allmän del.

Tabell 15. Lista över Yersinia-stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer

Bakterie	CCUG	ATCC	Karakteristika	Växt (1) på CIN
Y. enterocolitica O3	8 233		Normalvariant, indol-	>50
Y. enterocolitica O8	33 055	27 729	Normalvariant, indol-	>10
Y. enterocolitica O9	82 39A		Normalvariant, indol+	>50
Y. pseudotuberculosis	17 342			>25 (2)

• 1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s. antalet CFU på test¬agar x100/antalet CFU på kontroll¬agar (CLED eller MacConkey), se Bilaga 1.2 sub¬strat-prövning.
• 2) Efter 2 dygns inkubering.

Referensserum

Yersinia O3 och O9 (Reagensia AB)

Resistensbestämning och resistensutveckling

Inga studier talar för gynnsam effekt av antibiotikabehandling på duration av tarmsymtom. Utdragna eller komplicerade infektioner kan behandlas med doxycyklin eller fluorokinoloner, dock med osäker effekt på uppkomsten av reaktiv artrit. Septisk Yersinia-infektion behandlas med fluorokinoloner, trim/sulfa eller senare generationer av cefalosporiner.

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Det skall observeras att vissa stam-mar av Y. enterocolitica inte betraktas som humanpatogena (se inledningen). Flertalet sådana icke humanpatogena stammar har hittills visats vara eskulin-positiva. Därför har testning för eskulinhydrolys medtagits i referensmetodiken.