Bilaga 1 (CNS)

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Bilaga 1

Detektion av bakterier i direktutstryk: Gramfärgning

Reagens

Initialfärgning

• Kristallviolett, stamlösning
  • Kristallviolett 100 g
  • (Merck art nr 15940)
  • Etanol 96 % 750 mL

VARNING! Etanol är brandfarligt.

• Ammoniumoxalatlösning 1 %
  • Di-ammonium oxalat monohydrat (pro analysi)

• Kristallviolett brukslösning
  • Kristallviolett stamlösning 100 mL
  • Ammoniumoxalatlösning 1 % 500 mL
  • Renat vatten, ex dest. eller FRO 400 mL
  • (FRO=Filtered Reversed Osmosis)

Anvisning:

Brukslösningen filtreras genom filtrerpapper innan den används.

Förvaring: Rumstempertaur

Fixering av utstryk

• Lugol, brukslösning
  • Jodkristaller puriss 1 g
  • Kaliumjodid (pro analysi) 2 g
  • Renat vatten, ex dest. eller FRO 300 mL

Anvisning:

Lös jodkristallerna med kaliumjodiden i vatten.

Autoklaveras ej.

Förvaring: Mörk flaska i rumstemperatur

Avfärgning

• Acetonsprit
  • Aceton (puriss) (KEBO art nr 2. 1015-1) 20 mL
  • Etanol (96 %) 80 mL

Förvaring: Rumstemperatur

Som alternativ kan ren etanol (96 %) användas.

VARNING! Mycket brandfarligt.

Kontrastfärg

• Karbolfuchsin stamlösning
  • Basiskt fuchsin 8g
  • Etanol 90% 92 g
  • Fenol 90% 50 g
  • Renat vatten ad l000g

Hållbarhet: 3 år

Karbolfuchsin, bruksiösning: 10 mL stamlösning blandas med 90 mL renat vatten.

Förvaring: Rumstemperatur

Fixering av utstryk

• Lufttorka utstryket på en plan yta.
• Fixera över låga.
• Placera alternativt några droppar metanol på objektglaset. Låt ligga 2 min. Låt kvarvarande metanol rinna av utan att skölja och låt utstryket lufttorka igen.

Färgningsprocedur

• Flöda det fixerade preparatet med kristallviolettlösning. Låt färgen ligga kvar i 30 sek. Häll av kristallviolettlösningen. Skölj bort resterande lösning med Lugols lösning och flöda sedan med mer Lugols lösning. Låt lösningen ligga kvar i 60 sek.
• Avfärga genom att låta acetonspriten flöda över utstryket medan objektglaset hålls i lutande vinkel. Sluta när ingen mer färg lossnar. Anpassa avfärgningen till tjockleken på utstryket. Skölj försiktigt bort överflöd av spritenlacetonspriten med kranvatten.
• Kontrastfärga genom att hälla på karbolfuchsin 15 sek. Skölj försiktigt bort kontrastfärgen med kranvatten. Torka objektglaset i stående position eller använd en kommersiell objektglastorkare.