Bilaga 1 Bakteriologiska substratrecept-NLI

Till innehållsförteckningen för Nedre luftvägsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005

---

Bakteriologiska substratrecept

De enskilda laboratoriernas substratval följer traditioner baserade på lokala erfarenheter, kunskaper och uppfattningar. Tanken är att referenssubstraten skall utgöra valideringsgrund vid det lokala substratvalet. Ett problem vid sådana valsituationer är att olika fabrikat av ett substrat med synbarligen samma recept (eller olika recept för den delen) kan ha olika egenskaper och fungera mer eller mindre väl. Betydande batchvariationer förekommer också. Det är alltså lämpligt att t.ex. inför en upphandling jämföra angivet referenssubstrat mot en uppsättning av alternativa substrat där det förra inte nödvändigtvis är det som visar sig ha de bästa egenskaperna.

För referenssubstraten anges firmanamn och katalognummer för spårbarhet till typrecept. Nedanstående substratbeskrivningar avseende allmän odling av nedre luftvägsprov finns också i vissa stycken mer utförligt beskrivna i I 1 2:a upplagan 2002 (MacConkeyagar) och I 11 (blodagar, hematinagar, CLED-agar, anaerob blodagar, FAB, TSB och MSA-platta). I I 1 och I 11 finns också angivet alternativa beredningsformer eller alternativ för flera av substraten. Samtliga angivna fabrikat av referenssubstrat är CE-märkta enligt IVD-direktivet.

1.1. Substrat för allmän odling av nedre luftvägsprov

Rekommenderade referensstammar och växtkarakteristika för vissa substrat Se I 11, Tabell 14a-c (Blodagar, Hematinagar, CLED-agar, anaerob blodagar, anaerob anrikningsbuljong).

1.1.1 Blodagar

Indikation: Substrat anrikat med hästblod för isolering av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer samt olika gramnegativa stavar, Neisseria (ej gonokocker), stafylokocker, pneumokocker och streptokocker från kliniska prov.

Princip: Columbia blodagarbas är ett välkomponerat grundmedium med bland annat kaseinhydrolysat och köttextrakt som kväve- och kolhydratkällor avsett att användas anrikat med 5-10 % valfritt blod. Vanligen används 5 % defibrinerat hästblod vilket ger distinkt betahemolys med olika streptokocker, vissa stammar av enterokocker och Listeria. Defibrinerat hästblod har ringa tendens att chelera metalljoner och ger ofta frodigare kolonier än om citratblod används. Många fabrikat av Columbia blodagarbas är inte avpassade för citratblod vilket också gäller referenssubstratet. Betahemolys orsakas av hemolys av de röda blodkropparna medan alfahemolys orsakas av att hemoglobinet i helt eller delvis intakta röda blodkroppar reduceras till methemoglobin. För blodagar avsedd för påvisande av betastreptokocker i svalgodlingar brukar istället 5-10 % fårblod rekommenderas, eftersom exempelvis enterokocker ofta inte ger betahemolys på sådant blod. Fårblod tenderar också att undertrycka normalflora, särskilt Haemophilus, mer än hästblod. Fårblodplattor kan gjutas dubbelskiktade för att underlätta avläsningen. Växtkarakteristika: På hästblodagar växer de flesta bakteriearter ut inom ett dygn. Kolonistorlek och utseende varierar kraftigt mellan olika arter trots att mediet inte i klassisk bemärkelse är differentierande. Flera bakteriearter uppvisar alfa- eller betahemolys, den senare med större säkerhet om plattorna inkuberas anaerobt. Ett flertal bakterietyper växer svagt eller inte alls på hästblodagar. Dit hör bland andra Haemophilus influenzae, Legionella och gonokocker.

Recept: (Columbia blodagarbas, Acumedia no 7125)

• Innehåll---- Gram/L
• Pankreasdigererat kasein---- 5,0
• Köttextrakt---- 8,0
• Jästanrikad pepton---- 10,0
• Majsstärkelse---- 1,0
• NaCl---- 5,0
• Agar---- 14,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C

Bered 5 % blodagar genom tillsats av sterilt, defibrinerat hästblod (alternativt fårblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.

1.1.2. Hematinagar (Chokladiserad blodagar)

Indikation: Näringsberikat medium för isolering av gonokocker, meningokocker och Haemophilus influenzae från kliniska prov. Resistensbestämning av gonokocker.

Princip: Gc-agarbasbaserat medium som näringsberikas antingen med hemoglobin (torkat nötblod) och IsoVitaleX eller med hemolyserat hästblod och hästserum. Gc-agarbas utnyttjar som många andra blodagarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt som kväve- och kolhydratkälla. Reducerad agarmängd och fosfatbuffring bidrar till bättre och snabbare växt av framförallt gonokocker. Hemoglobin och IsoVitaleX (liksom lyserat hästblod och serum) tillför mediet bland annat X-faktor och V-faktor, en förutsättning för växt av H. influenzae, men bidrar också till god växt av Neisseria-arter. Hematinagar används också med tillsats av selekterande antibiotika (Modifierad Thayer-Martin-agar, VCNT-supplement) för isolering av gonokocker från kliniska prov.

Växtkarakteristika: Meningokocker, gonokocker och Haemophilus växer inom ett dygn med ”feta” blanka gråa kolonier, diameter 0,5-2 mm. På hematinagar växer också inom ett dygn (ofta med kraftigare växt efter två dygn) pneumokocker och streptokocker med tydlig alfahemolys (gäller inte t.ex. GBS), stafylokocker (vita eller gulgråa kolonier), Listeria (stora matta platta kolonier) och ett flertal arter av gramnegativa stavar (stora ofta ”råa” kolonier). Candida albicans växer inom ett till två dygn med karakteristiskt ”stjärn-” formade vita, matta kolonier.

Recept: (Gc-agarbas, Acumedia no 7104)

• Innehåll---- Gram/L
• Pankreasdigererat kasein---- 7,5
• Köttextrakt---- 7,5
• Majsstärkelse---- 1,0
• Di-kaliumfosfat---- 4,0
• Mono-kaliumfosfat---- 1,0
• NaCl---- 5,0
• Agar---- 10,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred hematinagar genom tillsats av hemoglobinpulver 10 g och IsoVitaleX 10,0 mL enligt tillverkarens anvisningar.

Recept: IsoVitaleX (BBL, no 11876)

• Innehåll---- Gram/L
• Vitamin B12---- 0,1
• L-glutamin---- 10,0
• Adenin---- 1,0
• Guanin HCl---- 0,03
• p-Aminobensoesyra---- 0,013
• Nikotinamid-adenin-dinukleotid---- 0,25
• Tiamin pyrofosfat---- 0,1
• Järnnitrat---- 0,02
• Tiamin HCl---- 0,003
• L-cystein HCl---- 25,9
• L-cystin---- 1,1
• D-Glukos---- 100,0

1.1.3 CLED-agar

Indikation: Referenssubstrat för (i första hand) isolering av urinvägspatogener från urinprov, och Enterobacteriaceae vid allmän odling.

Princip: CLED är en förkortning av Cystein-Lactose-Electrolyt-Deficient utvecklat av Sandys och Mackey. Substratet är icke-inhibitoriskt men inte lika näringsrikt som blodagar. Innehåller såväl kaseinhydrolysat som köttextrakt och understödjer därmed växt av ett stort antal kliniskt relevanta bakterietyper. Karakteristiskt för detta substrat är avsaknaden av elektrolyter, vilket hindrar svärmning i första hand av Proteus. Mindre selektivt men för övrigt funktionellt nära saltfri MacConkeyagar. Laktospositiva bakterier blir gula medan laktosnegativa behåller mediets blåa grundfärg. Kontaminanter från urogenital flora (laktobaciller, mikrokocker och difteroider) växer ofta ut som mikrokolonier på plattan, vilket indikerar förorening.

Växtkarakteristika: E. coli och andra gramnegativa bakterier växer inom ett dygn med relativt stora (diameter >2mm), opaka, blanka, släta kolonier. Laktospositiva bakterier blir gulfärgade, ofta med gult färgomslag i substratet. Grampositiva bakterier som stafylokocker och enterokocker växer med mindre, ofta gula kolonier (diameter 1-2mm). Growth index för de flesta bakterietyper nära de för blodagar.

Recept: CLED-agar (enligt Mackey och Sandys, OXOID CM301)

• Innehåll---- Gram/L
• Pepton---- 4,0
• ”Lab-Lemco” pulver---- 3,0
• Trypton---- 4,0
• Laktos---- 10,0
• L-cystein---- 0,128
• Bromtymolblått---- 0,02
• Agar---- 15,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C

1.1.4 Anaerob blodagar (FAA)

Indikation: Substrat avsett för primär isolering av flera typer av kliniskt relevanta anaeroba bakterier från kliniska prov.

Princip: Fastidious anaerobe agar (FAA) är en i grunden väl balanserad blodagarbas med speciell peptonmix som kväve- och främsta kolhydratkälla. Mediet innehåller stärkelse och bikarbonat vilka båda neutraliserar toxiska metaboliter. FAA innehåller också hemin och vitamin K, vilka utgör tillväxtfaktorer för ett flertal arter av anaeroba bakterier. Cystein sänker redoxpotentialen och pyruvat bidrar till neutralisering av väteperoxid. Substratet förstärks med 5 % hästblod, vilket förutom att bidra med ytterligare tillväxtfaktorer också möjliggör bedömning av hemolys.

Växtkarakteristika: Se I 11 bilaga 3, tabell 14.

Recept: Fastidious anaerobe agar (FAA, LABM Lab 90)

• Innehåll---- Gram/L
• Peptonmix---- 23,0
• NaCl---- 5,0
• Stärkelse---- 1,0
• Agar no 2---- 12,0
• Na-bikarbonat---- 0,4
• Glukos---- 1,0
• Na-pyruvat---- 1,0
• Cystein HCl monohydrat---- 0,5
• Hemin---- 0,01
• Vitamin K (menadion)---- 0,001
• L-arginin---- 1,0
• Pyrofosfat---- 0,25
• Na-succinat---- 0,5

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred 5 % anaerob blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hästblod enligt tillverkarens anvisningar. Vid utvidgad anaerob diagnostik är bruk av selektiv anaerob blodagar referensmetod. FAA och andra medier kan göras selektiva för anaeroba bakterier genom antibiotikatillsats. Traditionellt används ofta så kallad kanamycin (75 – 100 mg/L) –vankomycin (7,5 mg/L) –agar (referenssubstrat). Denna är selektiv för Bacteroides fragilis-gruppen och också lämpad för isolering av pigmenterade Prevotella species. Det skall dock observe¬ras att flera Bacteroides-arter, Wolinella, fusobakterier, Bilophila och Porphyromonas liksom grampositiva anaerober ej växer på detta selektiva substrat.

FAA med tillsats av neomycin, 100 mg/L, (referenssubstrat) är särskilt lämpad för isolering av klostridier. Den inhiberar Enterobacteriaceae, men också vissa gramnegativa anaerober.

1.1.5 Anaerob anrikningsbuljong (FAB)

Indikation: För anrikning av ett stort antal kliniskt relevanta aeroba och anaeroba bakterier från kliniska prover och eventuellt transport av kliniska prover.

Princip: FAB är ett mycket näringsrikt substrat baserat på speciell peptonmixtur som kväve- och kolhydratkälla och med jästextrakt som näringstillskott. L-cystein och Na-tioglykollat bidrar till att reducera buljongen. Små mängder agar bidrar till att bibehålla anaerobios (redoxindikator resazurin, rosa färgomslag i översta buljongskiktet indikerar aerob miljö där, men för övrigt anaerob miljö i röret). Till skillnad från andra tioglykollatbuljonger och CM-buljong är hemin och menadion tillsatta redan till grundberedningen. Trots goda egenskaper uppvisar FAB liksom övriga anaeroba buljongtyper ofta svag växt av fusobakterier och anaeroba grampositiva kocker, vilka kan kräva tre till sju dygns inkubationstid.

Recept: Tioglykollatbuljong-FAB (LabM, LAB 71 )

• Innehåll---- Gram/L
• Peptonmixtur---- 5,0
• Jästextrakt---- 10,0
• NaCl---- 2,5
• L-cystein---- 0,5
• Na-tioglykollat---- 0,5
• Agar no 1---- 0,75
• Resazurin---- 0,001
• Na-bikarbonat---- 0,4
• Hemin---- 0,005
• Vitamin K (menadion)---- 0,0005

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

1.2 Selektiva substrat för Pseudomonas, Burkholderia, Bordetella och Legionella

1.2.1 Pseudomonas aeruginosa

För selektiv isolering av Pseudomonas aeruginosa från kliniska prov finns ett antal kommersiellt utvecklade substrat tillgängliga. Dessa baseras främst på gelatininnehållande pepton och glycerol samt tillsats av kalium, magnesium och sulfat för att understödja pyocyaninproduktion, en egenskap unik för P. aeruginosa (King et al, 1954). Medierna tillåter också god fluoresceinproduktion, en egenskap som dock inte är unik för Pseudomonas. Selektivitet för P. aeruginosa erhålles genom tillsats av cetrimid (cetyl trimetyl ammoniumbromid, i vissa beredningsformer i reducerad mängd tillsammans med andra antimikrobiella substanser som nalidixinsyra, cefalotin och fusidinsyra (de två senare medlen i kombination ger selektivitet för Pseudomonas sensu stricto).

Cetrimidagar

Indikation: Referenssubstrat för selektiv isolering av Pseudomonas aeruginosa i kliniska luftvägsprover, i första hand från patienter med cystisk fibros. Påvisande av pyocyanin- (och fluorescein-) produktion hos P. aeruginosa. Agartypen rekommenderas i såväl europisk som amerikansk farmakopé.

Princip: Substratet baseras på King’s A-medium som komponerades för att differentiera P. aeruginosa-isolat från andra bakterier. Detta åstadkoms genom mediets innehåll av magnesium, kalium och sulfat vilka stimulerar pyocyaninbildningen. Typiska kolonier blir grönblåaktiga och omges av en blågrön pigmentskiftning i mediet, orsakad av den kombinerade effekten av pyocyanin och pyoverdin (fluorescein). Vissa stammar av P. aeruginosa producerar också andra typer av pigment som pyorubin, eller pyomelanin. Ibland kan dessa pigment ta överhanden och maskera pyocyanin vilket resulterar i gulvita, rödaktiga eller brunaktiga kolonier. Några procent av P. aeruginosa-stammar producerar inget pigment, varvid kolonierna blir ofärgade. Särskilt prevalent är detta bland de mukoida stammar som isoleras från CF-patienter.

Bromföreningen cetrimid är toxisk för de flesta bakteriearter med undantag av några arter inom gruppen Psedomonas sensu stricto. Särskilt är P. aeruginosa och P. fluorescens resistenta, men ca 6-10 % av isolaten är känsliga för cetrimid.

Växtkarakteristika: På cetrimidagar som är blekt gulvit och genomskinlig växer P. aeruginosa CCUG 551 med platta, råa, 1-3 mm stora grönaktiga ställvis metallglänsande kolonier i 37 °C (och 41 °C) inom 24 timmar. Kolonierna omges av grönblå färgskiftning i mediet. Mukoida stammar växer utan omslag i mediet. Samtidig förekomst av mycket små kolonier är typiskt. Growth index relativt blodagar drygt 50 %.

Referensstammarna av B. cepacia genomovar I och II och Pandoraea spp växer med ofärgade till vitgula kolonier. Enstaka kolonier av Stenotrophomonas maltophilia och Citrobacter braakii kan också växa fram efter förlängd inkubering till 48 tim. Burkholderia gladioli, Achromobacter xylosoxidans och Ralstonia pickettii växer mycket svagt eller inte alls.

Recept: Cetrimidagar (Difco, No. 285420)

• Innehåll---- Gram/L
• Pankreasdigererat gelatin---- 20,0
• Magnesiumklorid---- 1,4
• Kaliumsulfat---- 10,0
• Cetrimid---- 0,3
• Agar 13,6

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

• Kontrollstammar
  • P. aeruginosa CCUG 551,
  • E. coli CCUG 17620.

Alternativt substrat för selektiv isolering av P. aeruginosa: Ett ofta använt alternativt substrat, liksom referenssubstratet baserat på King´s A-medium, är Pseudomonas isolation agar där cetrimid bytts mot den brett antimikrobiella substansen Irgasan (finns också i t.ex. CIN-agar för selektiv isolering av Yersinia). Egenskaper för övrigt likvärdiga cetrimidagar.

Recept: Pseudomonas isolation agar (Difco, No 292710.)

• Innehåll---- Gram/L
• Pepton---- 20,0
• Magnesiumklorid---- 1,4
• Kaliumsulfat---- 10,0
• Irgasan---- 25,0
• Agar---- 13,6

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillreds enligt tillverkarens anvisningar.

REFERENSER

• King, B.S., Ward, M.K.W. & Roney, D.E. 1954. J Lab Clin Med. 44:301.

1.2.2 Burkholderia cepacia-komplexet

Eftersom kolonisering av luftvägarna med Burkholderia cepacia-bakterier får omfattande konsekvenser för CF-patienterna, är det av stor betydelse att förutsättningarna för isolering från luftvägssekret är optimerade. Gilligan och medarbetare utvecklade ett medium för ändamålet med bland annat tikarcillin och polymyxin B som selektiva komponenter, vilket väsentligen förbättrade såväl sensitivitet som specificitet framför MacConkeyagar som tidigare varit vanlig för primär isolering av B. cepacia (Gilligan et al, 1985). På grund av mediets goda selektiva egenskaper innefattande undertryckandet av de flesta Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. och Stenotrophomonas maltophilia, har det kommit till utbredd användning. I dag används ofta ett något modifierat substrat, ”MASTs Burkholderia selective agar” vilket nedan anges som referenssubstrat. Ett substrat, utvecklat av Henry och medarbetare (1997) rekommenderas i ASM-manualen, åttonde upplagan, och har nyligen blivit kommersiellt tillgängligt. Detta (BCSA) anges nedan som alternativt substrat och har i en ny studie jämförts mot MASTs substrat och befunnits vara väl så bra som detta, t. o. m. med något snabbare tillväxt av målbakterien.

Indikation: För selektiv isolering av Burkholderia cepacia-komplexet från kliniska luftvägsprover, i första hand från patienter med cystisk fibros.

Princip: Referenssubstratet är en modifierad variant av Gilligans ursprungliga formulering. Det har en välbalanserad komposition med oorganiska salter och pepton för snabb tillväxt av målbakterien. Selektivitet för B. cepacia-komplexet uppnås genom gallsalter, kristallviolett och antimikrobiella medel (tikarcillin och polymyxin B). Trots dessa selektiva komponenter växer målbakterierna i princip lika bra som på fårblodagar, och lika bra eller bättre än på MacConkeyagar. Genomslag av övrig flora är ringa, men kan förekomma med jästsvamp, P. aeruginosa, Alcaligenes spp och Pandoraea spp.

Växtkarakteristika: Målbakterierna växer från 24 tim upp till 5 dygn, varvid majoriteten inom 48 tim, med 1-2 mm stora vita eller gulgrå kolonier, efter några dygn ibland med metalliskt inslag. Kolonierna omges av ett rosa omslag i mediet. Det skall observeras att olika genomovarianter av B. cepacia växer olika bra, således växer referensstammen B. multivorans (genomovar. II) oftast med endast ringa växt. Detsamma gäller Burkholderia gladioli, Achromobacter xylosoxidans och Ralstonia pickettii.

Recept: (MASTs Burkholderia selective agar, “Cepaciaplattor” MAST Diagnostics DM 253)

• Innehåll---- Gram/L
• Magnesium sulfat---- 0,2
• Järn-ammoniumsulfat---- 0,01
• Kalium dihydrofosfat---- 4,35
• Di- Na –vätefosfat---- 1,42
• Gallsalter---- 0,5
• Agar A (RM10)--- 12,0
• Ammoniumsulfat---- 1,0
• Peptonblandning---- 8,0
• Kristallviolett---- 0,001
• Fenolrött---- 0,02
• Na-pyruvat---- 5,0

pH 6,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred Burkholderia selective agar enligt tillverkarens anvisningar och tillsätt tikarcillin, slutkonc. 100 mg/L och polymyxin B, slutkonc. 300.000 U/L.

• Kontrollstammar
  • Burkholderia cepacia CCUG 12691,
  • P. aeruginosa CCUG 551,
  • E. coli CCUG 17620.

Alternativt substrat för selektiv isolering av B. cepacia-komplexet: Ett substrat som senare jämförts mot Gilligans ursprungliga medium och även mot referenssubstratet (MAST DM 253) utvecklades i USA av D.A. Henry och medarbetare (BCSA, Henry et al. 1997). Detta substrat har väl så bra sensitivitet för målorganismerna som referenssubstratet, framförallt i form av snabbare växt, men också bättre specificitet med genomslag av färre kontaminanter ur luftvägsfloran. B. gladioli växer något bättre på BCSA än på Gilligans medium. Däremot kan vissa grampositiva kocker som E. faecalis slå igenom på BCSA. Substratet rekommenderas i senaste ASM-manualen, och har nyligen blivit kommersiellt tillgängligt.

Recept: Burkholderia cepacia selective agar (BCSA) enligt Henry och medarbetare.

• Innehåll---- Gram/L
• Trypticase pepton---- 10,0
• NaCl---- 5,0
• Sackaros---- 10,0
• Laktos---- 10,0
• Fenolrött---- 0,08
• Kristallviolett---- 0,002
• Jästextrakt---- 1,5
• Agar (BD)---- 14,0

pH 6,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred substratet med tillsats av följande selektiva substanser: Polymyxin B, slutkonc. 600.000 U/L, gentamicin 10 mg/L och vankomycin 2,5 mg/L.

REFERENSER

• Henry, D.A., et al. 1997. Identification of Burkholderia cepacia isolates from patients with cystic fibrosis and use of a single new selective medium. J Clin. Microbiol. 35:614-619.
• Wright, R.M., et al. 2001. Improved cultural detection of Burkholderia cepacia from sputum in patients with cystic fibrosis. J. Clin. Pathol. 54:803-805.
• Gilligan, P.H., et al. 1985. Isolation medium for the recovery of Pseudomonas cepacia from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 22:5-8.
• Gilligan, P H et al. Burkholderia, Stenotrophomonas etc. In Manual of Clinical Microbiology, 8 th edition. Chapter 48, Vol. 1; 729-748.

1.2.3 Bordetella pertussis och parapertussis

För nära 100 år sedan utvecklade Bordet och Gengou ett substrat för isolering av Bordetella baserat på potatisstärkelse och fårblod. Detta substrat fick omfattande spridning och har först under senare decennier ersatts av ett annat likvärdigt (Charcoalagar) men med betydligt längre hållbarhet. De båda substraten används på vissa laboratorier parallellt.

Charcoalagar med hästblod och cefalexin

Indikation: För selektiv isolering av Bordetella pertussis/parapertussis från nasofarynxprov.

Princip: Medium utvecklat för odling av B. pertussis/parapertussis och H. influenzae, från början utan blodtillsats för odling inför tillverkning av kikhostevaccin. För kliniskt bruk har mediet senare optimerats genom tillsats av 10 % hästblod och cefalexin, 40 mg/L (Regan & Lowe, 1977, avser också anrikningsmedium med halva substratmängden). I det fasta referenssubstratet ingår helblod i stället för lyserat blod som ofta användes till anrikningsmediet. Dessutom ingår nikotinsyra som är en essentiell tillväxtfaktor för Bordetella. Ett huvudproblem vid isolering av B. pertussis från nasofarynxsekret är undertryckandet av annan flora på plattorna under den långa inkubationstiden. Bland det flertal selektiva substanser som prövats har cefalexin utkristalliserats som den i sammanhanget mest effektiva. Val av cefalexin i stället för t.ex. penicillin eller meticillin innebär också att mediets hållbarhet förlängts avsevärt. Endast Pseudomonas och vissa svampar slår igenom på substratet.

Växtkarakteristika: Efter ca 3 dygn uppträder B. pertussis som mycket små grå, konvexa, opaka skinande kolonier som ser ut som ”kvicksilverdroppar”. B. parapertussis växer med större (ca 1 mm) kolonier, blanka med ljust brunrosa färg.

H. influenzae växer med mycket små, vattendroppslika kolonier. Grampositiva kocker växer ej. P. aeruginosa växer med ca 5 mm stora platta grön-rosa kolonier. Candida albicans växer med torra råa rosaskiftande kolonier, ca 1 mm stora.

Recept: Charcoalagar (OXOID, CM119) med 10 % hästblod och cefalexin 40 mg/L

• Innehåll---- Gram/L
• LabLemco pulver---- 10,0
• Pepton---- 10,0
• Bakteriologiskt kol---- 4,0
• NaCl---- 5,0
• Nikotinsyra---- 0,001
• Agar---- 12,0

pH 7,4 ± 0,2 vid 25 °C

Bered selektiv pertussisagar genom tillsats av 10 % defibrinerat hästblod och cefalexin 40 mg/L.

• Kontrollstammar
  • Bordetella pertussis CCUG 34132,
  • B. parapertussis CCUG 413,
  • Bordetella pertussis CCUG 34133 (svagväxande variant),
  • S. aureus CCUG 17621.

Transport- och anrikningsmedium för B. pertussis

För detta ändamål används charcoalagar beredd till halva styrkan (Regan and Lowe, 1977). Därefter tillsättes 10 % defibrinerat lyserat hästblod och cefalexin till 40 mg/L.

Alternativt substrat för isolering av B. pertussis/parapertussis från nasofarynxprov

Bordet-Gengou agar med helblod erbjuder ett alternativ till charcoalagar. Substratet utvecklades redan 1906 men har sedan dess modifierats, bland annat genom tillsats av högvärdig pepton. Detta utelämnades i den ursprungliga formuleringen för att göra mediet i viss mån selektivt. Baseras för övrigt på potatisstärkelse som vid tiden var populär som bas i fasta medier. B. pertussis växer inom 3-4 dygn med mycket små, konvexa pärlemorskimrande kolonier omgivna av en smal zon med betahemolys. De skiljer sig distinkt från B. parapertussis och B. bronchiseptica som växer med bruna pigmenterade kolonier. Mediet är känsligt för uttorkning och har kort hållbarhet. Har använts speciellt för bedsideodling. Idag torde användningsområdet inskränka sig till subkultur efter anrikning i Regan-Lowes anrikningsmedium. Därvid har mediet visats vara likvärdigt med charcoalagar (Kurzynski et al. 1988).

Recept: Bordet-Gengou agar bas (OXOID CM267) med glycerol, hästblod och cefalexin

• Innehåll---- Gram/L
• Infusion av potatis---- 4,5
• Proteose pepton---- 10,0
• NaCl---- 5,5
• Agar---- 16,0

Bered Bordet-Gengouagar genom tillsats av 1 % glycerol i destillerat vatten. Tillsätt 15-20 % defibrinerat hästblod och cefalexin 40 mg/L. Mediet är ljust körsbärsrött och bör användas omedelbart eller lagras fuktigt under upp till en vecka. De skall inte användas om den ursprungliga färgen förändrats.

REFERENSER

• Bordet, J., and Gengou, O. 1906. Le microbe de la coqueluche. Ann Inst. Pasteur. 20:731-741.

• Regan, J., and Lowe, F. 1977. Enrichment medium for the isolation of Bordetella. J. Clin. Microbiol. 6: 303-309.

• Müller, F-M.C. et al. 1977. Minireview. Laboratory diagnosis of pertussis: State of the art in 1977. J. Clin. Microbiol. 35: 2435-2443.

• Kurzynski, T.A., et al. 1988. Comparison of modified Bordet-Gengou and modified Regan-Lowe media for the isolation of B. pertussis/parapertussis. J. Clin. Microbiol. 26:2661-2663.

1.2.4 Legionella

Odlingsdiagnostiken av Legionella spp baseras på specialkomponerade fasta substrat som kan göras selektiva med särskilda tillsatser. Vanligen används BCYE-agar (referenssubstrat) efter Edelstein´s formulering från 1981, vilken innehåller aktiverat kol, jästextrakt och för Legionella essentiella växtfaktorer som L-cystein och -ketoglutarsyra. Selektivitet uppnås genom tillsats av bland annat vankomycin, polymyxin B och anisomycin (MWY-medium, selektivt referens¬substrat).

Buffered charcoal yeast extract agar (BCYE-agar)

Indikation: För isolering av Legionella species från kliniska luftvägsprov.

Princip: BCYE-agar innehåller jästextrakt som proteinkälla, L-cystein, järnpyrofosfat och alfa-ketoglutarsyra, de tre sista komponenterna essentiella för Legionella spp. som järnkälla och vid omsättningen av aminosyror. Aktiverat kol inaktiverar toxiska metaboliter som väteperoxid och binder koldioxid. Kolet sänker också ytspänningen vilket underlättar mikrobiell profilering. ACES buffert liksom KOH (i stället för NaOH då Na är toxiskt för Legionella) bevarar effektivt optimalt pH.

Vid beredningen av BCYE-agar kan ett identiskt medium där L-cystein utelämnas (ej referenssubstrat) tillverkas. Detta understödjer inte växt av Legionella och kan användas som parallell odlingskontroll.

BCYE-agar kan göras selektiv för Legionella spp. genom tillsats av polymyxin B, anisomycin, vankomycin och glycin. Samtidigt tillsättes bromkresolpurpur och bromtymolblått för infärgning av Legionella (modifierad Wadowsky and Yee Medium, MWY-(medium, referenssubstrat).

Växtkarakteristika: Legionella spp. växer på BCYE-agar och MWY-medium men inte på cysteinfritt medium, blodagar, hematinagar eller CLED-agar. Legionella växer inom 2-3 dygn med 1-2 mm stora vita blanka/mukoida kolonier, på MWY med vit-gröna (L. pneumophila) till blå-gröna kolonier. Se för övrigt under Legionella i speciella delen av denna bok.

Recept: BCYE-agar. (Referenssubstrat anges ej men kommersiellt tillgängliga halvfabrikat och supplement finns)

• Jästextrakt DIFCO alternativt BBL---- 10,0 g
• Activated charcoal, Norit A eller Merck 2184 ---- 1,5 g
• Löst i destillerat vatten och autoklaverat separat.

• ACES buffert, Sigma---- 10,0 g
• K-salt av α-ketoglutarsyra, Sigma---- 1,0 g

pH justeras till 6,85-6,95 med KOH. Observera att detta måste ske före tillsats av agar, eftersom glutarsyra och ACES buffert båda är mycket sura.

• Agar, Bactoagar, DIFCO ---- 17,0 g
• Dest. vatten ---- ad 1000 mL

Autoklaveras vid 120 °C i 20 min, kyles därefter till 50 °C.

Efter avsvalning tillsätts:

• L-cystein HCL H₂O, löst i 10 mL dest vatten---- 0,4 g
• ferric pyrophosphate soluble, löst i 10 mL dest. vatten---- 0,25 g

Recept: MWY Medium (selektivt supplement till Legionella agar bas, finns kommersiellt tillgängligt)

• Tillsats till ovanstående medium, till 100 mL beräknas:
  • Glycin---- 0,3 g
  • Vankomycin---- 0,1 mg
  • Polymyxin ---- 5000 U
  • Anisomycin---- 8 mg
  • Bromtymolblått---- 1 mg
  • Bromkresolpurpur ---- 1 mg

1 Används för att hämma ev svampväxt. Anisomycin är dyrt och kan uteslutas i rutin, men det bör finnas en beredskap att användas vid behov.

• Sterilfiltreras

Plattorna är hållbara 3 veckor under mörk plast i 4 °C.

• Kontrollstammar
  • Legionella pneumophila CCUG 9568,
  • Legionella (Fluoribacter) bozemanii CCUG 11880.

REFERENS

• Edelstein, P.H. 1981. Improved semiselective medium for isolation of Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental specimens. J. Clin. Microbiol. 14:298-303.