Clostridium difficile-laboratoriediagnostik

Huvudartikel: Clostridium difficile

Se också: Bilaga 5. Clostridium difficile-cytotoxin;analysprocedur

---

Laboratoriediagnostik av Clostridium difficile

Allmänt

Diagnostik av C. difficile-medierad sjukdom omfattar i första hand påvisning av toxin i feces. Referensmetod för toxindetektion är påvisning av cytotoxin, toxin B, i cellkultur. Flertalet cellinjer kan användas. Vissa fibroblastlinjer, t.ex. HEL-celler, reagerar på bråkdelar av picogram av C. difficile-cytotoxin. Följande indikationer för diagnostik är motiverade

• Speciell misstanke på Clostridium difficile-medierad diarré efter, eller i samband med antibiotikabehandling eller annan behandling som kan tänkas rubba tarmfloran.
• Kontroll av behandlingseffekt efter behandlad C. difficile-infektion.
• Screening vid diarréutbrott på vårdavdelningar. Odling kan vara motiverad som komplement vid negativ toxintest men fortsatt klinisk misstanke vid epidemiologisk frågeställning.

Referensmetodik

Påvisning av Clostridium difficile cytotoxin B i cellkultur är referensmetod.

• Semikvantitativ påvisning av Clostridium difficile cytotoxin i feces görs med hjälp av en för toxinet känslig cellinje, t.ex. humana embryonala lungfibroblaster (HEL). Specifikt neutraliserande C. difficile antitoxin används för verifiering.
• Analysprocedur se Bilaga 5

Omsättning av prov

Prov som analyserats i cellplatta där inte den positiva och/eller negativa kontrollen fungerat sätts om.

Kvalitetskontroll

Internkontroll

C. difficile cytotoxin används vid varje analystillfälle som kontroll på cellerna. C. difficile antitoxin används vid varje neutralisationstesttillfälle som kontroll på C. difficile toxinet (positiv kontroll).

Felkällor

• Otillräckligt med provmaterial.
• Felaktig förvaring av provet (förvaring utan kylning före transport, under transport eller i laboratoriet före analys). En 25-faldig reduktion av cytotoxintitern sker efter 5 dygn i rumstemperatur och en 3-faldig reduktion inom 5 dygn vid förvaring i kylskåp. I frystemperatur är titern stabil.

Alternativ diagnostik

Påvisning av C. difficile toxin med Enzyme immunoassay (EIA)

Under senare år har ett flertal kommersiella tester baserade på ELISA-teknik utvecklats med vilka enbart toxin A eller både toxin A och toxin B samtidigt kan detekteras. Med kännedom om att toxin A-/B+ stammar förekommer kan tester som endast detekterar toxin A ej rekommenderas. Det har däremot diskuterats om tester som detekterar toxin A och toxin B samtidigt på sikt ska kunna anses som alternativ, eller ersätta, celltest som referensmetod. Fördelen med EIA-tester är att de är snabba, svar kan erhållas inom 3 timmar efter det att prov omhändertagits i laboratoriet. Nackdelen är framför allt att känsligheten är lägre jämfört med referensmetoden, vilket medför att en låg toxinhalt i ett prov ej kommer att kunna detekteras.

Sensitivitet och specificitet för EIA-tester (toxin A + B) jämfört med referensmetoden varierar mellan 64 och 93 %, respektive 93 och 99 % med positiva prediktiva värden från 84 till 100 % och negativa prediktiva värden från 80 till 99 %.

Idag använder flertalet svenska laboratorier EIA-test för påvisning av C. difficile-toxin.

Analysprincip

Mikrotiterbrunnar med bottnar klädda med antikroppar riktade mot C. difficile toxin A och toxin B. Till brunnarna sätts spätt patientprov och monoklonala, enzymmärkta antikroppar riktade mot toxinerna A och B. Plattan inkuberas i värmeblock eller inkubator. Om toxinerna finns i provet bildas ett reaktivt komplex av toxin och enzymmärkta antikroppar. Efter tvättning tillsätts enzymsubstrat i form av ett färgämne och i närvaro av bundet enzym utvecklas färg i proportion till mängd bundna enzymmärkta antikroppar och därmed till mängden toxin. Stopplösning tillsätts och resultatet avläses på spektrofotometer.

EIA-testerna är enkla att utföra, alla reagenser, mikroplattor och utförlig beskrivning inkluderas i kit-lådan. Av erfarenhet kan dock några viktiga steg särskilt påpekas:

• Provet ska - oavsett konsistens - blandas noggrant innan provsättning.
• Botten på brunnarna får ej vidröras (skador i bottenbeklädningen resulterar i felaktigt absorbansvärde).
• Inkuberingen med enzymkonjugat bör göras på skak (minimerar antalet gränsvärden och falskt positiva resultat och förkortar dessutom testtiden).
• Inkuberingen med substrat ska göras i mörker.
• Utför tvättningen noga enligt beskrivningen (för att undvika hög bakgrundsreaktion).

Serologi

Det har visats att framför allt äldre personer med C. difficile-recidiv saknar antikroppar mot cytotoxin i blodet. Denna iakttagelse har dock ej fått praktisk användning.

Bakterieodling

Referenssubstrat

• CCFA (cykloserin-cefoxitin-fruktos agar, se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat), selektivt medium för primärodling.
• Oselektivt blodhaltigt medium till anaerobodling och isolering av C. difficile.
• Anaerob buljong för eventuell anrikning av pinnprov.

Isolering

• Primär utodling: Kvalitativ odling på selektivt medium.
• Fecesprov blandas med hjälp av en provtagningpinne och med pinnen görs ett primärstryk på CCFA-platta. Med platinös görs ett ganska tätt sekundärstryk över halva plattan och glesa tertiär- och kvartärstryk över den resterande halvan. CCFA-plattan inkuberas efter inokulering i anaerob miljö i totalt minst 2 dygn.

• Pinnprov utodlas på samma sätt.

Vid eventuell anrikning inokuleras provet även i anaerob buljong. Buljongen inkuberas i minst 2 dygn och utodlas därefter på CCFA.

Anrikning är dock ej att betrakta som referensmetod.

Identifiering och minimikriterier

• Presumtiv diagnos: Identifiering baseras på karakteristisk lukt, fluorescens och mikroskopisk och makroskopisk morfologi.

• Preliminär avläsning: C. difficile-odling avläses under luppmikroskop (x 6 - 10). På CCFA (och andra blodhaltiga medier) växer C. difficile med grågröna, homogena och delvis utflytande kolonier, ca 2 mm, efter inkubering över natt och ca 4 mm efter 2 dygns inkubering. På CCFA-platta har C. difficile viss hästdoft, men doften kommer helt till sin rätt först på oselektivt blodhaltigt medium. Under UV-lampa fluorescerar kolonier av C. difficile grönt (chartreuse - det kan ta några sekunder innan fluorescensen uppträder). Även C. innocuum fluorescerar chartreuse, men koloniutseende och morfologi förhindrar förväxling.

• Odlingen anses som korrekt utförd om C. difficile-kontrollstammen växt.

Om odlingen inkuberats i anaerobbox görs en preliminär avläsning efter inkubering över natt. Vid misstänkt växt av C. difficile, eller om samtidig toxintest bedömts som positiv, tas plattan ut på laboratoriebänken och eventuella typiska kolonier isoleras till oselektivt blodhaltigt anaerob medium. Isolering inkuberas anaerobt över natt.

• Slutlig avläsning: Slutgiltig avläsning görs under luppmikroskop efter inkubering i minst 2 dygn. Om inga kolonier med typiskt utseende kan ses, bedöms odlingen som negativ.

Omsättning av prov

Prov omsätts om odlingen är negativ men samtidig toxin-test positiv, eller om den anaeroba miljön inte fungerat tillfredsställande.

• Minimikriterier för verifiering: Isolerad stam på oselektivt blodhaltigt medium har typisk kolonimorfologi och utpräglad hästdoft.

Under UV-lampa fluorescer kolonier i grönt (chartreuse). Gramfärgning visar grampositiva stavar med ovala subterminala sporer.

Kontroll av toxinproduktion på gjorda isolat kan vara befogat.

Referensstam

• C. difficile CCUG 4938T används som internkontroll på CCFA-plattor, som jämförelse vid luppmikroskopi, som kontroll på den anaeroba miljön och som kontrollstam vid eventuell resistensbestämning.

Felkällor

• Otillräckligt provmaterial.
• Lång transporttid.
• Felaktig förvaring av provet (förvaring utan kylning före transport, under transport, eller i laboratoriet före analys).
• Frysning av provet. Vid förvaring i fryskåp sker en närmast 100-faldig reduktion av antalet viabla C. difficile-organismer.
• Felaktigt odlingsförfarande (t.ex. otillräckligt anaerob miljö, för lång tid mellan utodling och inkubering).