Enterohemorragiska Escherichia coli-laboratoriediagnostik

Till huvudartikel Enterohemorragiska Escherichia coli (EHEC)

---

Laboratoriediagnostik

Allmänt

Sedan 980331 är STEC klassad som skyddsklass 3 (**) enl. AFS 1997:12, vilket innebär att särkilt tillstånd från Arbetsmiljöverket krävs för arbete med dessa organismer.

Diagnostiken hos människa är baserad på att med PCR påvisa stx-genen i utodlade prover. Påvisad stx1- och/eller stx2-gen utgör grunden för en EHEC-diagnos. Från positiva prover görs försök att isolera stx-positiv bakterie för artbestämning. För rapportering enligt smittskyddslagen av EHEC O157 krävs fastställande av serogrupp. Om försök att isolera EHEC misslyckas kan laboratoriediagnosen baseras enbart på PCR under förutsättning att detta förhållande uttrycks i svaret.

Det är angeläget att stx-positiva non-O157 isolat skickas till Folkhälsomyndigheten för serotypning och analys av flera virulensgener. Resultaten kommer att utgöra ett underlag för framtida virulensassocierad definition av EHEC och därmed sammanhängande revision av smittskyddslagen.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Se föregående avsnitt. Vid isolering/renspridning av EHEC O157:H7 kan CT-SMAC användas, se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat.

Primär isolering

Provet stryks på sorbitol-MacConkey agar (SMAC). Sekundär- och tertiärstryk görs med ögla. Plattan inkuberas över natt vid 36 °C - 38 °C och avläses. Plattan sparas i kyl.

Vid mycket små provmängder eller dålig växt på primärplatta odlas provet i buffrat peptonvatten (BPV) vid 42 °C i 24 tim (se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat). Detta material används direkt för PCR-screening, resp. IMS (se nedan) och utodling på SMAC.

PCR-screening

stx1, stx2 och eae påvisas med PCR på primärkultur eller enskilda kolonier. Metodbeskrivning ”Diarréframkallande Escherichia coli och shigatoxigena Enterobacteriaceae - påvisning med PCR”, som tillämpas vid Folkhälsomyndigheten bifogas som exempel (Bilaga 3. PCR-diagnostik av diarréframkallande E coli och EHEC).

Isolering av EHEC från PCR-positiva prover

O157:H7 och O157:H: Försök att isolera E. coli O157:H7 görs genom att bleka (sorbitol-negativa) kolonier från primärplatta plockas och testas med stx-PCR. Detta kan också utföras direkt utan föregående PCR-screening. Om PCR är positiv renstryks för artidentifiering och agglutination mot O157-antisera.

Om inga bleka kolonier typiska för E. coli O157:H7 syns på primärplattan kan omstrykning från PCR-positivt primärstryk till sekundärplatta med SMAC göras.

Ytterligare försök att isolera E. coli O157:H7 kan utföras med immunomagnetisk separation (IMS). Del av PCR-positivt primärstryk eller motsvarande fecesprov preanrikas i BPV eller GN-buljong (se manual för Dynabeads anti O157) och eventuella E. coli O157 anrikas med Dynabeads anti-E. coli O157 magne-tiska kulor (Dynal Biotech, Norge) enligt tillverkarens instruktioner. Magnetiska kulor med adsorberade bakterier sprids på SMAC. Efter inkubering syns ofta en blandflora på plattan eftersom metoden ej är helt specifik. Om bleka kolonier typiska för E. coli O157:H7 är synliga, plockas och renstryks dessa på SMAC för att därefter testas med stx-PCR.

Parallellt med odling på SMAC testas buljongkulturen och kulorna med stx-PCR. Del av buljongkulturen respektive kulorna inkuberas först vid 98 °C i 10 min och används direkt som templat i PCR. Om starkare eller lika stark positiv signal erhålls på kulorna som på buljongkulturen har O157 sannolikt anrikats. Svagare eller ingen signal på kulorna indikerar att provet sannolikt ej innehåller O157.

Om E. coli O157:H7 ej kunnat isoleras trots indikation på positiv IMS görs ytterligare ett anrikningsförsök men med de PCR-positiva kulorna som utgångspunkt. Anrikningen initieras även denna gång med odling i buljong. Två konsekutiva anrikningar utförs också på prover med svag signal vid den primära PCR-screeningen eftersom dessa kan få ett negativt PCR-resultat efter den första anrikningen.

O157:H- isoleras enklast genom anrikning med IMS och utodling på SMAC. Därefter testas röda (sorbitol-positiva) kolonier på sätt som anges nedan för non-O157.

Non-O157

Cirka 10 kolonier (med morfologi som E. coli) plockas och testas med PCR. Vid negativt resultat testas ett flertal pooler bestående av åtminstone 10 kolonier vardera. De ingående kolonierna i positiva pooler testas sedan separat.

Som alternativ metod kan kolonihybridisering med stx-probe användas, varvid material från primärstryket slammas i PBS, späds och sprids på SMAC till en täthet av 100-1000 CFU/platta. Positiva kolonier renstryks på SMAC och testas med stx-PCR.

Isolering med IMS, som finns tillgängligt för ett begränsat antal EHEC-serotyper från Dynal Biotech är ett alternativ.

Identifiering och minimikriterier

stx-positiva kolonier karakteriseras biokemiskt. Om resultatet är typiskt för E. coli anses isolatet identifierat som EHEC.

Även prov där stx-genen påvisats utan att enskild koloni identifierats kan besvaras positivt. Samtidig närvaro av eae-genen förstärker fyndet.

Om misstanke på EHEC O157:H7 finns utförs agglutinationstest i serogrupp specifikt antiserum (bilaga 2.2) på bleka kolonier från SMAC. Om sorbitol-negativt isolatet agglutinerar som O157 anses diagnosen EHEC O157 verifierad.

Isolat som ej agglutinerar i O157 skickas till Folkhälsomyndigheten för serotypning (O:H). Folkhälsomyndigheten utför också analys av ett flertal virulensgener. Även O157 skickas till Folkhälsomyndigheten för påvisande av H7-antigen med fliCH7-PCR och epidemiologisk typning med PFGE.

Alternativ diagnostik

Toxinpåvisning

Kommersiella kits för påvisning av Shigatoxin finns tillgängliga. För närvarande saknas erfarenhet av prestanda hos dessa jämfört med PCR på ett större svenskt material.

Serologi

Serologi för påvisande av antikroppar mot EHEC-LPS har beskrivits i litteraturen och kan t.ex. användas för att komplettera ett stx-positivt PCR-resultat i avsaknad av isolat. Folkhälsomyndigheten vidarebefordrar prover till Public Health England för O157-serologi.

Epidemiologisk typning

Folkhälsomyndigheten utför epidemiologisk typning av EHEC med PFGE och serotypning.

Kvalitetskontroll

• Referensstam
  • Escherichia coli ATCC 43887 eae (målgen)
  • Escherichia coli ATCC 43889 stx2 (målgen)
  • Escherichia coli ATCC 43890 stx1 (målgen)