Kvalitetssäkring och validering av PCR-baserade molekylärbiologiska metoder

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

---

Kvalitetssäkring och validering

Allt större andel av den mikrobiologiska diagnostiken bygger på molekylärbiologiska tekniker. För många av dessa diagnostiska metoder ansvarar det kliniska laboratoriet självt för prestanda, kvalitetssäkring och validering. Följande kapitel är skrivet för att landets laboratorier ska arbeta med detta efter enhetliga riktlinjer och tar också upp begreppen IVD och CE märkning av kit och instrument.

Kvalitetssäkring och validering av PCR-baserade molekylärbiologiska metoder

Kontroller inom kvalitativ PCR-baserad diagnostik

Det finns ingen standardiserad svensk nomenklatur för de olika kontroller och standards som används i samband med PCR-baserad diagnostik. Det råder också en viss begreppsförvirring där samma eller liknande benämningar används för olika saker. Ett exempel på det är ”intern kontroll” som i engelska texter (internal control) syftar på en kontroll som amplifieras tillsammans med provet. SWEDAC använder istället denna term som ett samlingsbegrepp för alla de kontroller vi använder internt på laboratoriet för ”att säkerställa att provningsmetoden uppför sig på avsett sätt”. Till skillnad från externa kontroller som är en ”externt organiserad provningsjämförelse…”.

Att mot denna bakgrund ge sig på att definiera termer för kontroller och standards inom molekylär mikrobiologisk diagnostik är vanskligt men nödvändigt.

• Intern kontroll eller internkontroll: Enligt SWEDAC-definition ”En intern kontroll eller internkontroll innebär oftast provning av ett material med egenskaper liknande provningsobjektets”.

• Extern kontroll: Enligt SWEDAC-definition ”En extern kontroll innebär en externt organiserad provningsjämförelse mellan flera provningslaboratorier”.

• Intern amplifieringskontroll (IAK): En positiv kontroll som amplifieras tillsammans med (i samma rör som) provet. Kontrollen kan vara endogen, naturligt förekommande i provet, eller exogen, tillsatt till provet. Kontrollen kan tillsättas till provet före eller efter extraktion/preparation. Denna kontrollerar amplifieringsreagenser, förekomst av inhibitorer i provet och även förlust av provmaterial under preparation om den tillsatts före extraktion/preparation.

• Extern amplifieringskontroll (EAK): En positiv kontroll som amplifieras separat från (men i samma reagenser som) provet. Kontrollen består av målsekvens av definierad koncentration. Denna kontrollerar amplifieringsreagenser.

• Negativ amplifieringskontroll (NAK): En amplifieringsreaktion som inte innehåller prov eller positivt material. Denna kontrollerar kontamination av reagenser och ospecificitet i amplifiering.

• Positiv extraktionskontroll (PEK): En kontroll som består av definierat antal hela målorganismer som prepareras/extraheras tillsammans med proverna. Denna kontrollerar preparation/extraktion och amplifiering.

• Negativ extraktionskontroll (NEK): En kontroll som inte innehåller målsekvens, men som består av buffert/spädningsmedium eller vatten. Denna prepareras/extraheras tillsammans med prover och positiv extraktionskontroll och kontrollerar kontamination mellan prover under preparation/extraktion (sample carry-over) och kontamination av extraktions- och PCR-reagenser.

• Standard: En positiv kontroll med känd koncentration av målsekvens. Denna kontrollerar att man upprätthåller för metoden angiven detektionsnivå. Koncentrationen av målsekvens bestäms med en oberoende metod (t.ex. spektrofotometri eller viable counts).

Kontrollernas användning

Syftet med användning av kontroller är att säkerställa att metoden, i alla dess steg, uppför sig på det sätt som definierats i valideringen och angivits vid en eventuell ackreditering. Vilka kontroller man väljer att använda för en given metod styrs delvis av vilka kontrollmaterial som finns tillgängliga för målsekvensen ifråga. Eftersom analyskostnaderna ökar med antal kontroller blir det också en avvägning av kvalitetsnivå mot analyskostnad. Nedan följer resonemang kring kontrollanvändning som kan tjäna som vägledning för vilka kontroller som skall inkluderas i en molekylärbiologisk metod.

• Extraktion/preparation: För att kontrollera extraktionen/preparationen används en PEK. Den kan utgöras av en känd mängd odlad målorganism alternativt av ett positivt patientprov som man späder till lämplig nivå. Genom att extrahera/upparbeta en NEK omedelbart efter PEK i provserien får man också en viss kontroll på kontamination mellan prover. En IAK som tillsätts innan extraktion kan inte helt ersätta en PEK eftersom den inte utgörs av hela organismer och därmed inte fullt ut kontrollerar extraktionen.

• Amplifiering: Eftersom en PEK följer med under hela processen kontrollerar den också amplifieringen. Om den består av en definierad mängd målorganismer kan den också fylla funktionen som standard. Observera att koncentration av målorganismer skall definieras med en oberoende metod. Om den istället består av spätt patientprov kan det vara lämpligt att i amplifieringssteget också använda en standard. Denna kan bestå av extraherat genomiskt DNA/RNA från målorgansimen eller delar av genomet, till exempel invitro-producerat RNA, klonat DNA eller PCR-amplikon. Standarden bör ha en koncentration som ligger nära, eller strax över, metodens detektionsnivå.

• Inhibition: Förekomst av inhibition varierar starkt mellan olika provtyper och påverkas också i stor utsträckning av vilken extraktions/preparationsmetod som används. Genom att inkludera en exogen IAK i varje prov kontrollerar man förekomst av inhibition i det enskilda provet fullt ut. En alternativ (och mindre kostsam) strategi kan vara att, som en del av valideringen av metoden, testa ett större antal kliniska prover för inhibition och utifrån resultatet av detta bedöma behovet av inhibitionskontroll i varje prov för metoden i fråga. Man skall då göra inhibitionstesten med samma amplifieringskemi som används i rutinmetoden eftersom olika kemier är olika känsliga för inhiberande substanser. Det är också viktigt att testen utförs nära metodens detektionsnivå eftersom inhibitionseffekten kan vara beroende av koncentration av målsekvens.

• Kontamination: Allt sedan PCR-tekniken introducerades i slutet av 1980-talet har kontamination, som leder till falskt positiva analysresultat, varit ett problem. Kontaminationsproblematiken finns inbyggt i tekniken eftersom man amplifierar upp, mångfaldigar, målmolekyler som i sin tur kan tjäna som templat för ny amplifiering. I och med introduktionen av realtids-PCR har dock problemet i princip försvunnit, eftersom amplifiering och detektion sker i ett slutet system. Om realtids-PCR inte används eller olyckan varit framme så att systemet inte varit slutet alternativt i förebyggande syfte kan det sk UNG (Uracil N-Gycosylas)-enzymet användas. Enzymet känner igen och förstör DNA som byggts med kvävebasen dUTP i stället för dTTP. Använder man alltså dUTP för sina PCR-reaktioner kan man låta UNG-enzymet bryta ner syntetiskt DNA innan amplifiering av patientmaterialet påbörjas. Kvar finns dock, som för alla känsliga analystekniker, en risk för överföring av provmaterial mellan prover under hanteringen innan PCR på laboratoriet (eng. sample carry-over). Det skall dock betonas att detta inte är ett problem som är unikt för PCR-teknik. Denna typ av kontamination minskar också med ökad användning av automatiserad provhantering (extraktions- och pipetteringsrobotar).

Ett sätt att rutinmässigt kontrollera hela processen för ”sample carry-over” är att hantera en PEK före en NEK i varje provserie. Lämpligen använder man då en PEK som inte är alltför svagt positiv. Man kan också lägga in NEK regelbundet i provserierna (vart femte eller vart tionde prov) vilket fungerar bra om man ofta har starkt positiva prover i analysen i fråga.

• Uppföljning och dokumentation av kontrollvärden: Realtids-PCR ger en bra möjlighet att följa en metods prestanda över tid. Genom att följa positiva kontrollers Ct/Cp-värde över tid upptäcks snabbt förändringar. Detta görs enklast genom att plotta kontrollvärdet i ett diagram. För att underlätta den dagliga övervakningen kan man lämpligen definiera gränsvärden för varje kontroll som aktuellt värde kan testas mot. Plus/minus två standardavvikelser kan vara lämpligt som larmgräns, kanske kombinerat med ytterliggare en gräns vid plus/minus tre standardavvikelser som markerar att analysen inte kan godkännas (stoppgräns). Denna typ av gränsvärden ger bra information om metodens relativa variation över tiden men säger ingenting om den absoluta variationen. Man bör därför också definiera hur mycket variation man accepterar för kontrollen genom att ha en gräns för variationskoefficienten.

Paneler

För att säkerställa att den metod man använder har utlovade prestanda skall man årligen delta i någon form av externt kvalitetssäkringsprogram. Det finns nationella program, EQUALIS, och internationella program, t ex QCMD, UK NEQAS, INSTAND och AcroMetrix Europe.

Dessa kvalitetssäkringsorgan sänder ut välkomponerade paneler där både analytisk känslighet och specificitet testas. Panelerna innehåller oftast olika stammar eller genotyper av den undersökta mikroorganismen så att metodens förmåga att detektera olika varianter testas.

Det är viktigt att man analyserar panelen som om det vore en del av rutindiagnostiken, eftersom meningen är att panelresultatet ska spegla den diagnostiska verkligheten.

Tendensen bland vissa paneltillverkare är att driva känslighetsparametern så långt som möjligt. Detta resulterar i att panelprov kan hamna i zonen där det är slumpen som avgör om prov-DNA/RNA amplifieras eller inte. Analyserar man då panelen på samma sätt som i rutindiagnostiken (ofta ett prov – en analys) kan slumpen leda till att utfallet varierar i de lågpositiva proven. Detta kan vara mycket frustrerande för laboratoriepersonalen då panelen ofta betraktas som ett ”facit på verksamheten”.

Hur ska man förhålla sig till panelresultaten?

Panelerna ger en objektiv indikation på hur metoden presterar. I tabellen nedan ges förslag på åtgärder baserat på olika utfall.

Utfall	Åtgärd
Missar prov som ligger under den egna definierade detektionsgränsen	Ingen åtgärd så länge den kliniska bilden inte kräver en känsligare metod
Missar prov som ligger över den egna definierade detektionsgränsen	Metoden måste revideras. Se över både på DNA/RNA-extraktion och PCR
Påvisar mikroorganismer i negativa prov	Se över den interna provhanteringen och identifiera kontaminationskällan
Missar prov av alternativ mikroorganism-stam eller genotyp	Metoden måste revideras så att alla cirkulerande stammar och genotyper inkluderas
Missar prov beroende på provmaterial	Se över vilka provmaterial man analyserar. Fundera på alternativ DNA/RNA-extraktion. Inkludera en inhibitionskontroll
Avviker i kvantifieringsresultat	Kalibrera interna standarden mot en känd standard

Trelabsjämförelse

För vissa analyser finns det inga externa kvalitetssäkringsprogram att tillgå. För att ändå säkerställa kvalitén på den egna metoden kan man aktivt söka samarbetspartner för en så kallad trelabsjämförelse. Dessa parter kan vara laboratorier i Sverige och övriga Europa.

Vid en sådan jämförelse ansvarar ett laboratorium för provutskick till de övriga parterna. Proverna kan bestå av avidentifierade patientprov eller odlade mikroorganismer i medium. Det är viktigt att utskickande laboratorium testar proven före skickningen. Vanligtvis skickas mellan tre och tio prover. Utskickande laboratorium analyserar om proven efter den tid som provtransporterna beräknas ta till de mottagande parterna, för att få en så rättvisande jämförelse som möjligt. Metoder som kvalitetssäkras med trelabsjämförelse kan ackrediteras.

Tips! Det kan vara bra att rotera distributionen av prover mellan samarbetsparterna.

Klinisk sensitivitet och specificitet

• Den kliniska sensitiviteten är detsamma som andelen sanna sjukdomsfall som påvisas med metoden.
• Den kliniska specificiteten är detsamma som andelen friska som får negativt testresultat med metoden.

För att avgöra en ny metods sensitivitet och specificitet måste den jämföras mot en beprövad metod där fynden i möjligaste mån har korrelerats till sjukdom/friskhet. Inom mikrobiologin används för sådana metoder begreppet referensmetod/jämförelsemetod. Molekylära metoder har tenderat att vara känsligare än vissa av de överenskomna referensmetoderna och tillkommande positiva fynd indikerar inte nödvändigtvis (även om så ibland kan vara fallet) bristande specificitet. Dessa prov bör därför konfirmeras av annat laboratorium eller med DNA-sekvensering, samt följas upp med avseende på den kliniska bilden.

Analytisk sensitivitet (detektionsnivå) och specificitet

• Analytisk sensitivitet: Den minsta mängd mål-DNA/RNA som metoden korrekt kan detektera kan benämnas som analytisk sensitivitet eller metodens detektionsgräns/nivå. I praktiken kan mål för gränsvärden (kalibreringsnivåer) för en viss metod beslutas utifrån resultat av explorativa EQAS-paneler eller av den koncentration som en viss andel av medverkande laboratorier klarat att påvisa.

• Analytisk specificitet: Metodens förmåga att bestämma enbart mål-DNA/RNA och korrekt identifiera sant negativa prov kan benämnas analytisk specificitet. Metodens analytiska specificitet bygger på hur unika primersekvenser vi valt, optimering av annealingtemperatur och magnesium-koncentration, samt korsreaktivitet med närbesläktade mikroorganismer. Man ska dock tänka på att en metod med 100 % analytisk specificitet inte behöver ha 100 % (klinisk) specificitet. Det finns t ex friskt bärarskap av diverse patogena organismer och en 100 % analytiskt specifik metod blir då falskt positiv. I tabellen nedan presenteras en sammanfattning över hur man beräknar en metods känslighet och specificitet.

Repeterbarhet

Metodens repeterbarhet, ett precisionsmått, skall alltid testas vid en metodvalidering. Förutsättningarna är att alla faktorer hålls konstanta, såsom prov, metod, reagens, instrument, person och laboratorium, samt att analysen sker inom en kort tidsrymd (en dag). Man testar prov med låg, medel och hög mängd mikroorganism-innehåll i 3-5 replikat (intra-assay). Resultatet anges som variationskoefficient (CV), det vill säga standardavvikelse/medelvärdet och uttrycks i % (% CV). Det är bra att veta att variationskoefficienten ökar med lägre koncentration av mikroorganism-DNA/RNA.

Det är mycket viktigt att man analyserar repeterbarheten hos en kvantitativ PCR-analys innan man tar den i diagnostiskt bruk. Detta ger en insikt om vilka kvantitativa nivåer som man kan svara med stor säkerhet och vid vilka nivåer som man bör vara försiktig på grund av dålig precision. Man kan välja att beräkna repeterbarheten på absoluta numeriska värden eller på logaritmerade värden (genkopior/mL). Variationskoefficienten kommer att vara mycket högre vid beräkningar med numeriska värden, varför det är rekommendabelt att använda logaritmerade värden.

Kvalitativa PCR-analyser kan bara besvaras positiva eller negativa. Därför uttrycks precisionen som frekvensen sant och falskt positiva (och negativa) resultat. Försöken utformas som vanliga intra- och inter-assays på patientprov som är positiva, negativa och på prov som producerar gränsvärden.

Reproducerbarhet

Vid undersökning av metodens reproducerbarhet undersöks hur olika faktorer, så som prov, metod, reagens, instrument, person och laboratorium, påverkar analysutfallet genom att en, flera eller alla tillåts variera. Det är viktigt att precisera vilka faktorer som varierar. Det kan röra sig om att samma prov analyseras under en veckas tid av olika personer (inter-assay). När några faktorer är lika och några är olika får man ett intermediärt precisionsmått som uttrycks med en variationskoefficient (%CV).

Tips! Utför intra- och inter-assay på samma gång så sparar du tid.

Robusthet

Innan man tar en metod i drift undersöker man metodens robusthet. Robusthetstestning av en analysmetod innebär att man undersöker små variationer i metodparametrar vid normalt användande. Anledningen till detta är att man vill identifiera vilka faktorer som är kritiska för analysens utfall. Om man kan identifiera faktorer som påverkar analysen negativt kan dessa faktorer hållas under kontroll eller förbättras så att analysens utfall alltid kommer att vara detsamma. Man kan t ex testa hur metoden uppför sig med olika batcher av extraktions- och PCR-reagenser, om några steg är tidspressade, användning av olika instrument eller hur olika användare påverkar analysresultatet. För att metoden ska betraktas som robust så bör analysresultatet vara opåverkat av ovan nämnda parametrar.

Utbyte med andra laboratorier

Vid validering av en ny molekylär metod kan det vara bra att samarbeta med andra laboratorier som har liknande metod i diagnostiskt bruk. Man kan utbyta paneler av patientprover eller parallellt analysera kliniska prover. Båda laboratorierna är vinnare på detta samarbete eftersom den nya metoden valideras och den gamla kvalitetssäkras.

Ett annat laboratorieutbyte sker också vid extern testning av positiva driftkontroller, men detta behöver ej utföras på prototypstammar.

Klinisk relevans vid nukleinsyrapåvisning

Direktpåvisning av DNA och RNA med molekylär amplifieringsteknik har ökat både känsligheten och specificiteten. Utvecklingen har gått snabbt och inte alltid hållit jämna steg med den kliniska verkligheten.

Är ett positivt fynd alltid associerat till sjukdom?

Först och främst ska man fundera på vilket provmaterial man analyserar och hur mycket mikroorganismer man kan förvänta sig i det vid en infektion. Cerebrospinalvätska (CSF) innehåller t ex ofta mycket låga mängder mikroorganismer vid en infektion i hjärnan. Detta kommer att generera svagt positiva resultat (höga Ct-värden) i en PCR-analys. Här är det av största vikt att metoden är så känslig som möjligt. Ett positivt fynd korrelerar alltid till sjukdom, då det inte ska finnas mikroorganismer i CSF.

Kommer fyndet från asymptomatiskt bärarskap eller från avdödade mikroorganismer?

Vissa infektioner ger en långvarig utsöndring av mikroorganismer efter den akuta sjukdomsfasen där den kliniska relevansen kan ifrågasättas. Denna utsöndring kan ofta korreleras till låga kvantitativa mängder (höga Ct-värden). Påvisning av mikroorganismen ska rapporteras, men gärna följas med en kommentar om det är känt att mikroorganismen utsöndras under lång tid efter akut sjukdom. Utsöndringen kan också spegla döda mikroorganismers DNA/RNA då till exempel en infektion har behandlats med antibiotika. Här är det viktigt att ha kunskap om hur lång tid ”falsk positivitet” kvarstår efter behandling. Till exempel rekommenderas ett uppföljningsprov på en klamydiainfektion först tre till fyra veckor efter avslutad behandling.

Kan det vara en låggradig kontaminant?

Arbete med amplifierat material eller med patientprover innehållande höga mängder mikroorganismer är alltid förknippat med kontaminationsrisker. Därför ska lågpositiva resultat (höga Ct-värden) alltid bedömas kritiskt.

Är det ett oväsentligt bifynd?

Oväntade fynd eller bifynd i ett patientprov ska alltid tolkas utifrån den kliniska bilden. Ett sådant fynd bör alltid repeteras innan det svaras ut. Dessa fynd är kanske i nuläget svårvärderade men bidrar dock till ny och breddad kunskap på längre sikt. Tolkningen av positiva fynd kan förbättras med introduktion av realtids-PCR då de uppmätta Ct-värdena ger en vink om mängden påvisat DNA/RNA och därmed indirekt kvantiteten av mikroorganismer i provet. Kvantifiering av prover ger oss mer kunskap om infektionstillstånd och kommer framgent att hjälpa oss med kliniska ställningstaganden.