MRSA-screening enligt Halmstadmodellen

Artikel uppdaterad april 2012

---

Till förgreningssidan MRSA

---

MRSA-screening enligt ”Halmstadmodellen”

Introduktion

Metoden gör det möjligt att utesluta förekomst av MRSA i 80-90 % av negativa prover inom ett dygn. Övriga prover odlas ytterligare ett eller två dygn innan de kan slutsvaras. För att åstadkomma detta odlas provet i en selektiv buljong (4 mg/L cefoxitin) över natt. Antalet S. aureus celler i buljongen bestäms sedan med en kvantitativ realtids-PCR baserad på nuc-genen enligt Brakstad et al,$^{1}$ modifierad av Nilsson et al.$^{2}$ Principen bygger på att MRSA anrikas till påvisbara nivåer över cutoff, medan känsliga stammar gör detta i mycket mindre utsträckning. Specificiteten i PCR-steget är 80-90 %. De prover som innehåller S. aureus-antal under en definierad cutoff svaras ut som negativa. Övriga odlas ut på fasta substrat för MRSA-identifiering.

Prover som utfallit positiva med denna metod verifieras i en uppföljande PCR som beskrivs i artikeln Genotypisk MRSA-verifiering.

Anrikning och provpreparation

Provpinnen eller 50 µL urin inokuleras i 3-5 mL FOX-buljong.

• Recept: FOX-buljong
  • proteos peptone (Oxoid L85)----- 15,0 g/L
  • liver digest (Oxoid L27)----- 2,5 g/L
  • yeast extract (Oxoid L21 ----- 5,0 g/L
  • NaCl (Merck) ---------- 25,0 g/L
  • mannitol (Scharlov) ----- 10,0 g/L
  • phenyl red (Merck) ----- 16 mg/L
  • Cefoxitin (Sigma) ----- 4,0 mg
  • Aztreonam (Bristol-Meyers Squibb)----- 8 mg
• pH 7,0 ± 0,1 vid 25 °C

Inkubera också tunt inokulat av MRSA-kontrollstam CCUG35600 i ett rör som positiv preparationskontroll av nuc-genen. Inkubera 37 °C i skakinkubator (110 rpm) minst 16 timmar. Efter inkubering vortexas odlingen (undvik aerosol) och 100 µL förs över till sterilt 1,5 mL eppendorfrör. Om prover skall ”poolas” tag 100 µL av varje (högst 3 prover per pool) till ett rör. Centrifugera röret 14 000 rpm 3 minuter och avlägsna genast överfasen. Resuspendera pellet i halva ursprungsvolymen StafLys (20 mM Tris-HCl pH 7,6 (Sigma), 0,5 % Tween20 (Sigma), 0,5 % Igepal CA-630 (Sigma) och 60 µg/mL Proteinase K (Roche Diagnostics)). Inkubera sedan röret 56 °C 60 minuter följt av 5 minuter 95-99 °C. Centrifugera provet 10 000 rpm 1 minut inför PCR-analys.

Mängdstandard

Mängdstandard bereds i korthet från en övernattsodlad BHI-kultur av MRSA CCUG 35600. Med ”viable counts” bestäms CFU/mL för suspensionen varefter celler lyseras på samma sätt som proverna. Lysatet späds sedan i StafLys utan proteinase K till lämpliga koncentrationer utifrån ”viable count”-resultat (t.ex.$10^{8}$, $10^{6}$, $10^{5}$, $10^{4}$ CFU/mL).

Alternativt kan en mängdstandard beredas från isolerat och koncentrationsbestämt kromosomalt DNA från en S. aureus kontrollstam.

Kvantitativ nuc-PCR

Genom att analysera fyrapunkters mängdstandard parallellt med proverna kan antalet S. aureus-celler/mL i buljongerna bestämmas. Buljonger som innehåller färre än $10^{4}$ CFU/mL svaras ut som negativa, 10 µL av övriga buljonger odlas ut på fast substrat lämpliga för identifiering av S. aureus.

Reaktionsvolymen är 25 µL, använd 5 µL templat. Mastermixen innehåller 1 x Quanta Perfecta qPCR Fast mix (WWR), 0,9 μM vardera av primrar NUC4 och NUC5 samt 0, 25 μM av TaqMan-prob NUC-RQ.

Primer-och probsekvenser (4)

• • NUC4 5´- TCA AGT CTA AGT AGC TCA GCA AAT GC –3´
  • NUC5 5´- GAA GTT GCA CTA TAT ACT GTT GGA TCT TC –3´
  • NUC-RQ 5´-FAM-TCA CAA ACA GAT AAC GGC GTA AAT AGA AGT GGT TCT - TAMRA -3

• Temperaturprofil i RotorGene Q/6000
  • Enzymaktivering- 95 °C 3 minuter.
  • Amplifiering och detektion- 95 °C 3 sekunder. 65 °C 20 sekunder.
  • Fluorescensmätning Green channel 40 cykler.

Verifiering av MRSA

Prover som utfallit positiva med denna metod verifieras i en uppföljande PCR som beskrivs i artikeln Genotypisk MRSA-verifiering.

REFERENSER

• 1.Brakstad et al. 1992. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J Clin Microbiol. 30: 1654-1660.

• 2.39th Annual Meeting of the Infectious Society of America. 2001. San Fransisco paper n.o. 183: MRSA detection in patients in less than 24 h with a Light Cycler (Roche) real-time PCR-based method. Nilsson, P, & Ripa, T.

• 3. Nilsson, P., H. Alexandersson, and T. Ripa. 2005. Use of broth enrichment and real-time PCR to exclude the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in clinical samples: a sensitive screening approach. Clin Microbiol Infect. 11:1027-34.
• 4. Ej publicerad egen design av TaqMan-PCR. Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad.