Virologisk provtagning och referensmetodik-ÖLI

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Övre luftvägsinfektioner (ÖLI)

---

Virologisk provtagning och referensmetoder

Indikationer för rutinmässig provtagning vid misstänkt viral ÖLI

• Långdragen och svår sjukdom. Gäller vanligast körtelfeber och liknande tillstånd.
• Påvisande av herpesetiologi till orala blåsor påverkar behandlingsval.
• Positiv viral diagnos gör att antibiotikabehandling kan undvikas.
• Nosokomiala infektioner
• Epidemiologiska utredningar.

Referensmetodik, SMI

Körtelfeber

Epstein-Barrvirusinfektion diagnostiseras rutinmässigt serologiskt. Med referensmetoden för fastställande av pågående primär EBV-infektion detekteras IgG- och IgM-antikroppar mot de antigener, som uttrycks under EBVs lytiska infektion, och Ig-antikroppar mot EBVs transformerande antigener (EBNA).

Metod för detektion av IgG och IgM mot lytiska antigener

Antigen: Droppreparat med Burkitt lymfom-celler från en virusproducerande cellinje (P3HR1) (bil 16) fixeras i aceton. Färska preparat görs varje vecka. Serum späds i 0,9 % koksalt, PBS eller trypsineringsbuffert. Tillägg av 0,5 % bovint serumalbumin och 0,05 % Tween 20 (ELISA-buffert, Folkhälsomyndigheten) förändrar inte slutresultatet.

IgG-undersökning: Serumspädning 1/20 droppas på glaset. Inkuberas 1 timme, 37°C i fuktig kammare. Glaset sköljs x 3 i fys NaCl eller PBS. Fluoresceinmärkt anti-IgG antikropp i uttitrerad spädning droppas på glaset och inkuberas vid 37°C under 1 timme i fuktig kammare.

Preparaten sköljs ånyo x 3, och kontrafärgas i Evans blue (spädning 1:3 x 10) under minst 3 min. Monteras med glycerol 87 % i glycinbuffert 9/1. Avläses i fluorescensmikroskop under 400x förstoring. Mellan 1 och 5 % av cellerna uttrycker de lytiska antigenerna. Dessa har mycket varierande utseende, och viss vana krävs för att säkert kunna bedöma preparaten.

IgM-undersökning: Serumspädningar 1/20 och 1/80 droppas på glaset. Inkuberas i 37°C över natt i fuktig kammare. Sköljs x 3 i varm PBS. Fluoresceinmärkt anti-lgM antikropp (DAKO) i uttitrerad spädning inkuberas under 30 min i rumstemp, fuktig kammare. Preparaten sköljs ånyo x3, och kontrafärgas med Evans blue, sp 1/30000 under 2 min. Avläses i fluorescensmikroskop (400x). Vid positivt resultat görs omfärgning efter behandling med anti-IgG-antikropp (Behring, Gull) för avlägsnande av IgG och eventuell rheumatoid faktor.

Metod för detektion av komplementbindande antikroppar mot EBNA

Antigen: $10^{6}$ celler från en icke producerande EBV-transformerad Burkitt lymfomlinje (Raij eller NC 37) (bil 16) behandlas i 50 μl hypoton lösning (Karolinska Apoteket) ca 1 min. Används till 8 droppreparat. Preparaten fixeras i aceton/metanol 2/1.

Antikomplement-fluorescens: Serum späds i buffert såsom vid detektion av antikroppar mot lytiska antigen. Serumspädning 1/2 eller 1/5 inaktiveras i vattenbad, 56°C , 30 min. Serum droppas på glaset, och inkuberas 30 min i 37°C i fuktig kammare. Sköljs x 3 i NaCl. Serum från en EBV-negativ donator används som komplement i spädning 1/7. Hålls kallt i isbad under upptining och spädning. Droppas på glasen inkuberas 20 min i 37°C i fuktig kammare. Fluoresceinkonjugerat anti-C3c-konjugat i uttitrerad spädning inkuberas 30 min, 37°C i fuktig kammare. Preparaten monteras och avläses i fluorescensmikroskop (400x). Om antikroppar finns ses en granulerad eller prickig kärnfluorescens i alla celler.

Kontroll för ospecifik färgning: Celler från en icke EBV-transformerad lymfomlinje behandlas och färgas enligt ovan.

Bedömning: Vid primär EBV-infektion har patienten IgG- och IgM antikroppar mot lytiska antigener, men saknar EBNA.antikroppar. Hos 1-3 % kan IgM-antikroppar saknas, Förekomst av IgG-antikroppar mot lytiska antigener men avsaknad av IgM-antikroppar och EBNA-antikroppar kan indicera primär EBV-infektion, men uppföljningsprov behövs för säkerställande av diagnosen.

Herpes simplex-infektion

Virusisolering (referensmetod) och direktmikroskopi från blåsbottenskrap utförs enligt ref 2. Om typiska blåslesioner inte finns, men HSV-infektion ändå misstänks kan viusisolering göras på svalgsköljvätska. Patienten får skölja munnen i vatten, och gurglar därefter i 30 sek med NaCl eller transportmedium. Provet behandlas enligt referensmetodik. 1 6 (2).

Påvisande av influensavirus, RS-virus, parainfluensavirus 1-3 och adenovirus

Nasofarynxprov används för direktdiagnostik och virusisolering. Svalgsköljvätska kan även användas för virusisolering. Dessa infektioner kan även diagnostiseras serologiskt. För referensmetodik för provtagning och omhändertagande vid laboratoriet hänvisas till ref 1.

Rhinovirus, coronavirus och influensa C

Dessa virus ger mestadels så lindriga infektioner att diagnostik inte anses indicerad. Sådan finns heller ej för rutinbruk, men vid speciella frågeställningar kan tex virusisolering användas. Kontakt bör tas med viruslaboratoriet i varje enskilt fall före undersökning.

REFERENSER

• 1. Referensmetodik. Infektionsdiagnostik I 2. Nedre luftvägsinfektioner. SBL-tryck nr 123-1990

• 2. Referensmetodik. Infektionsdiagnostik I 6 Sexuellt överförbara infektioner. SMI-tryck nr 101-1994.