ÖLI-bilaga 16

Hoppa till: navigering, sök

Till innehĂ„llsförteckningen för Referensmetodik: Övre luftvĂ€gsinfektioner (ÖLI)


  • ÖLIbilaga16.jpg

Metod

1. Cellodling

CellinsÄdd: 50 000 celler/mL medium.

Odlingsbetingelser: 37°C, CO2 ej nödvÀndigt annat Àn vid uppodling av frusna celler. Odlingsflaskorna förvaras stÄende, eftersom cellerna vÀxer fritt i mediet.

Skötsel: Cellerna delas 1/2 en gÄng/vecka. HÀll bort sÄ mycket medium som möjligt, varefter flaskan skakas, och hÀlften av det kvarvarande mediet med celler hÀlls av (dessa celler kan odlas vidare för att fördubbla cellmÀngden eller anvÀndas för preparatframstÀllning). Tre dagar senare görs mediumbyte. Ca 3/4 av mediet hÀlls försiktigt av och ersÀtts med nytt.


Nedfrysning av celler

I kryorör sĂ€tts ca 2x10^7 celler/ml RPMI med 20 % inaktiverat fetalt kalvserum och 10 % DMS0. Nedfryses lĂ„ngsamt enligt laboratoriets metod för frysning av celler (speciell cellfrys Ă€r att föredra, annars exempelvis frigolitbox i -70°C över natt eller frĂ„n -20°C till halsen pĂ„ kvĂ€veklockan över natt). Cellerna slutförvaras i flytande kvĂ€ve.

Upptagning av nedfrusna celler: Kryorören tinas i rumstempererat vatten. InnehÄllet överförs till 25 cm^2 plastflaskor med 15 ml medium. Odlas i CO2.

Efter 24 timmar sugs det gamla mediet försiktigt av, och ersÀtts med nytt. NÀr mediet gulnat (brukar ta ca 4 dagar) sker delning och skötsel enligt tidigare angivna metoder.

PreparatframstÀllning

P3FIR1 (för detektion av antikroppar mot lytiska antigener): Cellkulturen anvĂ€nds 1 vecka efter delning. Medium med uppslammade celler centrifugeras (400g, 10 min), dĂ€refter ytterligare 2 ggr efter uppslamning i PBS. Cellerna rĂ€knas och slammas upp i PBS i en koncentration av 10^6/ml. Cellerna droppas pĂ„ rena objektglas (helst maskade) 20-30 ÎŒl/prep. FĂ„r lufttorka, och fixeras dĂ€refter i vattenfri, iskall aceton (5 min). Preparaten förvaras vid 4°C och kan anvĂ€ndas under 1 vecka.

NC37 (för framstĂ€llning av EBNA-preparat): Cellkultur anvĂ€nds 2 dagar efter delning. HĂ€ll bort 4/5 av mediet, centrifugera medium och celler 10 min, 400g. HĂ€ll bort supernatanten, slamma i 5 ml PBS. 5 ml cellsuspension sĂ€tts till ett rör med 2 ml Ficoll. Centrifugeras (400g, 20 min). Cellbandet sugs av och sköljs x 2 genom uppslamning i PBS och centrifugering. Cellema rĂ€knas i vitalfĂ€rgning. Minst 80 % ska vara levande för preparatframstĂ€llning Slamma cellerna i PBS, 5 milj/mL. Centrifugera och sug bottensatsen torr. TillsĂ€tt 200 ÎŒl hypotonlösning. Slamma upp cellerna och droppa pĂ„ objektglas. 5-10 ÎŒl/prep. Lufttorka, fixera i vattenfri aceton/metanol 2/1. Förvaras vid 70°C.