Bilaga 3 NukleinsyrapÄvisning-NLI

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Nedre luftvÀgsinfektioner inklusive mykobakteriologisk diagnostik, 2:a upplagan 2005


NukleinsyrapÄvisning-NLI

NukleinsyrapÄvisning av Mycoplasma pneumoniae

PCR Analysprincip: Analys sker med PCR–metod genom amplifiering av konserverade nukleinsyra-(DNA)-sekvenser (mĂ„l–DNA) inom gen för Mycoplasma pneumoniae P–1 adhesin protein. Vid analysen upphettas provet sĂ„ att DNA denatureras. Primers specifika för i provet eventuellt befintligt mĂ„l–DNA binder till detta. Med hjĂ€lp av termostabilt polymeras kopieras dĂ€refter mĂ„l–DNA - sekvenserna under 40 cykler vilket resulterar i ca 10^9 kopior av amplimer med 466 baspar. Detektion av slutprodukten sker med elektrofores.

Reagens

  • Primer 1 och 2 (p-11 och p12):
  • p-11: 5ÂŽ-TGC CAT CAA CCC GCG CTT AAC –3ÂŽ
  • p-12: 5ÂŽ-CCT TTG CAA CTG CTC ATA GTA –3
  • AmpliTaq Polymeras (Applied Biosystems), Biotech 10xPCR – buffert med BSA och30 mM MgCl2. 10x Sucrose/cresol (Biotech), 10x dNTP mix (CHASE, Applied Biosystems).
  • Amplicor Respiratory Specimen Preparation Kit (”Lysis reagent”, Roche Diagnostics).

Kontroller: Negativ kontroll och kontaminationskontroll: sd H2O.

  • Positiv kontroll: Renat DNA frĂ„n M. pneumoniae (Quiagen).

Analysprocedur

  • DNA-extraktion
    • Vortexa rör med kvarvarande pinne minst 1 minut. Pipettera 1 mL till sterilt eppendorfrör. Centrifugera 15 min och pipettera av överfasen.
    • TillsĂ€tt 50 ÎŒL ”lysis reagent” och skaka upp pelleten. Inkubera rören 45 minuter vid 60 °C pĂ„ vĂ€rmeblock eller vattenbad.
    • TillsĂ€tt 50 ÎŒL ”neutralisation reagent” och 100 ÎŒL sdH2O.
    • Ta av 5 ÎŒL och spĂ€d i 45 ÎŒL sdH2O (templat).
  • Mix/PCR-rör
    • sdH2O 3,9 ÎŒL
    • 10x buffert med BSA, 30 mM MgCl2 1,0 ÎŒL
    • 10xdNTP mix (CHASE) 1,0 ÎŒL
    • primer 1 (10 pmol/ÎŒL) 0,5 ÎŒL
    • primer 2 (10 pmol/ÎŒL) 0,5 ÎŒL
    • Taq-Polymeras 0,1 ÎŒL

TillsĂ€tt 2 ÎŒL templat – DNA (patientprov resp. kontroller) till resp. PCR-rör.

  • PCR-program
    • 15 sek 94 °C
    • 5 sek 94 °C
    • 5 sek 50 °C 40 cykler
    • 35 sek 72 °C
    • 30 sek 72 °C

Trippelprov körs pÄ alla patientprover.

Negativ kontroll och kontaminationskontroll: 2 ÎŒL dd H2O till 8 ÎŒL PCR – mix.

Positiv kontroll: 2 ÎŒL renat DNA frĂ„n M. pneumoniae till 8 ÎŒL PCR-mix.

Identifiering Gelelektrofores Utförs enligt lokal metod. Band med förvĂ€ntad storlek motsvarande 466 baspar avlĂ€ses som positivt PCR – resultat.

Kvalitetskontroll: För att körning skall godkÀnnas skall analyskontrollerna ge förvÀntat resultat och ge rÀtt bandstorlek.

Extern kontroll saknas för nÀrvarande.


Stammarna förvaras i –70 °C.



NukleinsyrapÄvisning av Chlamydophila pneumoniae

PCR-undersökning avseende Chlamydophila pneumoniae och C. psittaci modifierad frÄn Tong och Sillis (1993). Metoden har prövats under lÄng tid och vid flera laboratorier och har rekommenderats som referensmetod tillsammans med ytterligare ett par metoder ( Dowell et al. 2001).

Metoden bygger pÄ en PCR i tvÄ steg med efterföljande gelelektrofores.

Prov extraheras med Magna Pure eller liknande.

10 ”L prov sÀtts till 40 ”L PCR-mix bestÄende av 200 ”M av varje nukleotid samt 0,5 ”M av varje primer. Taq-polymeras 1,5 enheter /prov (Promega, Madison, WI, USA) i buffert A tillsammans med Mg-klorid 2,0 mM ingÄr ocksÄ i mixen.

Efter första PCR-omgÄngen spÀds provet 1/50 i vatten varefter en ny PCR-omgÄng med inre primers utföres enl. ovan.

  • PCR-steg
    • 95 ÂșC i 3 min
    • dĂ€refter
    • 95 ÂșC i 1,5 min, 56 ÂșC i 1,5 min och 72 ÂșC
    • 40 cykler
  • Primers
    • Externa (sense): 5ÂŽ-TTA CAA GCC TTG CCT GTA GG – 3ÂŽ
    • (anti-sense): 5`-GCG ATC CCA AAT GTT TAA GGC – 3`
    • Interna (sense): 5`- TTA TTA ATT GAT GGT ACA ATA – 3`
    • (anti-sense): 5ÂŽ- ATC TAC GGC AGT AGT ATA GTT – 3ÂŽ

Gelelektrofores utförs i 2 %-ig agarosgel i TBE-buffert med etidiumbromid enl. standardrecept.


REFERENSER

  • Tong CY, Sillis M. 1993. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR. J Clin Pathol. 46:313-7.
  • Dowell SF, Peeling RW, Boman J, Carlone GM, Fields BS, Guarner J, Hammerschlag MR, Jackson LA, Kuo CC, Maass M, Messmer TO, Talkington DF, Tondella ML, Zaki SR. 2001. Standardizing Chlamydia pneumoniae assays: recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis. 33:492-503.



NukleinsyrapÄvisning av Bordetella pertussis (ej referensmetodik)

Analysprincip: DNA-sekvenser förstÀrks genom PCR av realtidstyp med probe detektion av R-Q-typ, Àven kallad TAQManŸprobe. Metoden Àr modifierad efter Kosters K, 2001. MÄlgenen utgörs av IS481, ett repeterat DNA-element som förekommer i B. pertussis men dÀr Àven andra Bordetella spp kan bÀra samma eller liknande sekvenselement. Metoden har rekommenderats av en europeisk grupp för studier av B. pertussis toxin, recA eller annan alternativ mÄlgen.

Vid positiv B. pertussis-PCR bör Àven primÀrt provmaterial utodlas och erhÄllen stam sÀndas till FolkhÀlsomyndigheten, alternativt sÀnds primÀrt provmaterial direkt till FolkhÀlsomyndigheten för odling. FolkhÀlsomyndigheten som utför epidemiologisk typning ersÀtter insÀndande laboratorium för insÀnt isolat.

Reagens

  • DNA-extraktion
    • Roche respiratory kit (Amplicor)
  • Oligonukleotider:
    • Forward (PPert): ATC AAG CAC CGC TTT ACC C
    • Reverse (APPert): TTG GGA GTT CTG GTA GGT GTG
    • Probe(SPert) FAM-AAT GGC AAG GCC GAA CGC TTC A.Dabcyl

Utförande

  • Provberedning
    • Pinnprov och nasofarynxutsug, i andra hand andra typer av sekret frĂ„n luftvĂ€garna. Provtagningspinne placeras i ett sterilt rör med ca 1 mL vatten och vortexas dĂ€refter. Suspenderat prov överförs till lagringsrör. Provtagningssetet sparas i kyl till efter PCR-analysen.
  • DNA-extraktion
    • 1. 200 ÎŒL wash buffert tillsĂ€tts 200 ÎŒL prov.
    • 2. Blandas pĂ„ vortex och centrifugeras 10 min 12500 rpm.
    • 3. Överfasen avlĂ€gsnas och 100 ÎŒL lysis buffert tillsĂ€tts.
    • 4. Proverna vortexas snabbt och spinns ner innan de inkuberas 45 min i 60 °C.
    • 5. Proverna spinns ner snabbt och 100ÎŒL neutralisationsbuffert tillsĂ€tts. Proverna vortexas snabbt och spinns ner.
    • 6. Proverna fördelas pĂ„ tvĂ„ rör och fryses i –70 °C. Om analysen utförs samma dag, vilket förordas, förvaras en alikvot i kyl för denna analys.
  • Realtids-PCR
    • 12,5 ÎŒL Hotstar-mix (QIAgen)
    • 600 nM Forward-primer (PPert)
    • 900 nM Reverse-primer (APPert)
    • 300 nM MgCl2 (1,5 mM MgCl2 motsvarar 1xHotstar Taq-mix)

Total volym per reaktion: 25 ÎŒL (20 ÎŒL mix och 5 ÎŒL templat).

  • Program (Instrument Rotorgene 3000)
    • 15 min 95 °C
    • [15 s 95 °C, 1 min 57 °C]x45 (avlĂ€sning av fluorescensen efter 1 min 57 °C).


REFERENSER

  • Kosters K, Riffelmann M, Wirsing von König C H. 2001. Evaluation of a real-time PCR assay for detection of Bordatella pertussis and B. parapertussis in clinical samples. J Med Microbiol 50: 436-440.