Bilaga 4 (CNS)

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet


Bilaga 4

Enterovirus: Detektion av RNA med PCR-teknik enligt metod frÄn Virusavdelningen, Huddinge sjukhus

Provtagningsmaterial: CerebrospinalvÀtska

Reagens

A. RNA-extraktion

  • Lysbuffert:
    • Guanidintiocyanat (Sigma), 4 mol/L
    • 25 mmol/L Natriumcitrat, pH 7,0
    • 0,5 % Natriumlaurylsarcosin

Denna stamlösning Àr hÄllbar i 3 mÄnader.

Till 100 mL stamlösning sĂ€tts 15,4 mg DTT’ (ditiotreitol) till en slutkoncentration av 1,0 mniol/L före anvĂ€ndandet.

  • Glykogen typ IX (Sigma) 1 mg/mL
  • Isopropanol -20 °C
  • Etanol 70 %
  • RNAsin 40 units/ÎŒL (Scandinavian Diagnostic Services) (SDS)

B. RT-PCR

  • PCR-buffert (Perkin-Elmer 10 x PCR-buffert II):
    • 100 mmol/L Tris-HC1, pH 8,3, 500 mol/L KC1
    • MgCl2 (Perkin-Elmer): 25 mmol/L
    • Taq-polymeras = vĂ€rmestabilt DNA-polymeras (AmpliTaq i PerkinElmer: 5 units/ÎŒL
    • Revers Transkriptas M-JuLV 20 units/ÎŒL (Boehringer-Mannheim)
  • dNTP, pH cirka 7,0. dNTP = ekvimolar blandning av 2’-deoxyadenosin-S- triofosfat (Pharmacia; pulver; Na-salt). 1,25 mmol/L av varje nukleotid.
  • Startsekvenser (oligonukleotider; “primers”) i Enterovirus 5 icke translaterad region (UTR):
    • yttre: 1 5’-TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3
      • 2 5-GAAACACGGACACCCAAAGTA-3
    • inre: 3 5-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’

storlek pÄ PCR-fragment: 120 baspar


Elektroforesbuffert (10xTBE): Tris-HC1, 0,89 mol/L; Borsyra, 0,89 mol/L, EDTA (etylendiamintetraacetat-Na salt), 0,02 mol/L, pH 8,4. SpÀds 20x i Reversed Osmosis(RO)-vatten vid anvÀndning.

Agarosgelen, 3 % koncentration, gjuts i TBE-buffert.

Laddningsbuffert: BromfenolblĂ„tt (Chroma Geselischaft), 0,25 % (w/v); sukros 40 % (w/v)

Etidiumbromid (sigma), 10 mg/mL. Reagenset Àr mutagent, och skall alltid hanteras med handskar. Detta gÀller Àven etidiumbromidfÀrgade geler


Förbrukningsartiklar

0,5 mL PCR-rör med snÀppkork (Perkin-Elmer eller Treff)

NuSieve GTG (FMC-In Vitro) agaros

Pipettspetsar


Analysprocedur

De olika momenten i proceduren utförs i tre separata lokaler för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.


Provberedning ("Preplab")

  • 200 ÎŒL lysbuffert pipetteras i Sarstedtrör.
  • TillsĂ€tt 20 ÎŒL glykogen.
  • TillsĂ€tt 50 ÎŒL likvor i prov och kontroller.
  • Inkubera 10 min i rumstemperatur. 250 ÎŒL iskall isopropanol tillsĂ€tts och blandas pĂ„ Vortex.
  • Inkubera 5 min i rumstemperatur.
  • Centrifugera i kylcentrifug (+4 °C) 14.000 x g 10 min; supernatanten sugs av och kastas.
  • TillsĂ€tt 0,5 mL 70 % etanol.
  • Centrifugera i kylcentrifug (+4 °C) 14.000 x g 10 min; supernatanten sugs av och kastas.
  • Torka bottensatsen i vacuumtork ca 30 min.
  • Lös bottensatsen i 25 ÎŒL RO-vatten med RNAsin sp 1+24.
  • Förvara lösningen vid -70 °C.


UppsÀttning av reaktionsblandningen ("Rena rummet"; "pre-PCR2)

Reaktionsblandningen för kombinerad revers transkriptasreaktion och PCR (RT-PCR) blandas enligt följande (per rör):

10xPCR-buffert, 4 ÎŒL

dNTP-blandning (1,25 mmol/L av varje), 4 ÎŒL

MgC12 (25 mmol/L Perkin-Elmer), 2 ÎŒL (optimerad mĂ€ngd)

5xRT-buffert, 1 ÎŒL

Taq-polymeras (5 units/ÎŒL, Perkin-Elmer), 0,1 ÎŒL

yttre primer 1 (1 pmol/ÎŒL)

yttre primer 2 (1 pmol/ÎŒL)

RNAsin: 1 ÎŒL (40 units)

Revers transkriptas: 1,0 ÎŒL (20 units)

RO-vatten, 24,9 ÎŒL

Till 40 ÎŒL av reaktionsblandningen sĂ€tts 2-3 droppar paraffinolja (Merck-KEBOLab)


TillsĂ€ttning av prov (“Preplab”)

  • 10 ÎŒL prov tillsĂ€tts reaktionsblandningen under oljeskiktet.


Amplifiering I (“Apparatlab”)

Program för RT-PCR och första PCR-omgÄngen med yttre primers:

43 °C 60 min, 94 °C 5 min 1 cykel (RT-PCR)

95 °C 1 min, 45 °C 1 min, 72 °C 3 min 19 cykler

Total tid ca 3 tim och 30 min.


Andra PCR-omgÄngen ("nestning")

1 "rena rummet" blandas PCR reaktionslösning per rör enligt följande:

10 x PCR-buffert, 5 ÎŒL

dNTP-blandning (1,25 mmol/L av varje), 4 ÎŒL)

MgCl2 (25 mmol/L Perkin-Elmer), 2 ÎŒL (optimerad mĂ€ngd)

Taq-polymeras (5 units/ÎŒL), 0,2 ÎŒL

yttre primer 1(10 pmol/ÎŒL), 0,6 ÎŒL

inre primer 3 (10 pmol/ÎŒL), 0,6 ÎŒL

RO-vatten, 32,6 ÎŒL

Till 45 ÎŒL av reaktionsbiandningen sĂ€tts 2-3 droppar mineralolja


Amplifiering II

Program för andra PCR-omgÄngen med primers 1 och 3:

95 °C 5 min, 55 °C 30 sek, 72 °C 1 min: 1 cykel

95 °C 30 sek, 55 °C 30 sek, 72 °C 1 min: 33 cykler

95 °C 30 sek, 55 °C, 30 sek, 72 °C 5 min: 1 cykel

Total tid ca 2 tim, 30 min.


Elektrofores

15 ÎŒL frĂ„n det arnplifierade röret tas ut med mikropipett och blandas med 5 ÎŒL laddningsbuffert innehĂ„llande bromfenolblĂ„tt och sukros. Blandningen appliceras pĂ„ botten av brunnen. Samtidigt laddas en gel/storlekskontroll, dvs tidigare amplifierad produkt i en agarosgel. Elektroforesen fĂ„r gĂ„ ca 1 tim vid max 100V (liten gel; GNA 100, Pharmacia) eller vid max 140V (stor gel; HORIZON 11-14; BLR Life Technologies, mc.). Gelen sĂ€nks ned i etidiumbromid-”fĂ€rgbadet” (1 mg/L i 1/2x TBE-buffert) och fĂ„r inkubera i dragskĂ„p minst 15 min. Gelen avfĂ€rgas i RO-vatten i ca 5 min. Gelen fotograferas pĂ„ UV-bord.

KvalitetssÀkring

Intern kvalitetskontroll

En reagenskontroll inkluderas som omfattar alla reagens utan annan tillsats. Negativ kontroll bestĂ„r av alla reagens och 10 ÎŒL RO-vatten. Negativ kontroll tas med efter vart fjĂ€rde prov. TvĂ„ positiva interna kontroller inkluderas vid varje analystillfĂ€lle. Dessa utgörs av odlat echovirus 30 titrerat i sterilt RO-vatten och motsvarar 0,5 resp 0,05 TCID50. De positiva och negativa kontrollerna hanteras exakt sĂ„som patient- proven och parallellt med dessa. Vid var sjĂ€tte körning inkluderas förutom echovirus 30 Ă€ven positiva kontroller bestĂ„ende av coxsackie B5- och A9-isolat. TvĂ„ positiva kontroller av varje isolat inkluderas.

Krav för godkÀnd analys

Positiv kontroll skall visa band av rÀtt storlek och av adekvat styrka i agarosgelen. Inga negativa kontroller skall visa sÄdant band.

Duplikatanalyserna skall visa samstÀmmiga resultat. Utfaller analys med ett positivt och ett negativt resultat och analysomgÄngen för övrigt Àr tillfyllest kan provet i angelÀgna fall preliminÀrsvaras av ansvarig virolog. Tolkning sker genom samdiskussion med patientansvarig lÀkare. Provet analyseras Änyo.


ÅtgĂ€rd vid problem med kontrollerna

Om positiv kontroll ej Àr tillfredsstÀllande kan endast positiva prov svaras ut. Samtliga prov analyseras Änyo.

Om negativa kontroller visar kontamination kan endast negativa resultat utsvaras. Ev positiva resultat svaras först om förnyad analys ger identiskt resultat.