Bilaga 8 (CNS)

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet


Bilaga 8

Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k enligt metod frÄn Sahlgrenska sjukhuset, Göteborg, modifierad vid Smittskyddsinstitutet

Provtagningsmaterial

CerebrospinalvÀtska (Csv)

Förvaras vid 4 °C eller -20 °C fram till transporten

Transport vid rumstemperatur


Apparatur

PCR-apparat (TC- 1, Perkin Elmer)

Variabla pipetter, fördelade pÄ arbetsstationer

Elektroforesutrustning

Polaroidkamera

UV-ljusbord


Förbrukningsmaterial

0,5 mL PCR-rör

1,5 mL Eppendorfrör

0,5-10 ÎŒL tippar utan filter

0,5-10 ÎŒL tippar med filter

10-200 ÎŒL tippar utan filter

100-1000 ÎŒL tippar utan filter



Reagens

H20: Sterilt vatten (dest.vatten) av hög renhetsgrad

Olja: Mineralolja, light

Primers: Pharmacia Biotech

Förvaras i -20 °C i Rena rummet


Koncentrationer:

1,4 ÎŒmol/L: CMVI och CMV2

2,8 ÎŒmol/L: CMV3 och CMV4

Samtliga primers Àr lokaliserade inom fjÀrde exonet av Major Immediate early gene (UL 122-123)


1:a amplifieringen

  • CMV1 5’-GCG CCG CAT TGA GGA GAT CTG CAT-3’
  • CMV2 5’-GAG CAC CCT CCT CCT crr CCT CAT-3’

Storlek pÄ PCR-fragment: 299 baspar


2:a amplifieringen

  • CMV3 5’-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3’
  • CMV4 5’-CAG CCA CAA TI’A CTG AGG ACA GAG-3’

Storlek pÄ PCR-fragment: 191 baspar


10 x PCR buffert II, Perkin Elmer

Förvaras vid 4 °C.


MgCl2, Perkin Elmer

Koncentration: 15 mmol/L,

Förvaras vid 4 °C.


dNTP, Pharmacia Biotech

Koncentration: 2 mmol/L anvÀnds i en blandning av samtliga nukleotider.

Förvaras vid -20 °C.


Enzym, Perkin Elmer

Taq polymeras 5 U/ÎŒL

Förvaras vid -20 °C.


Agaros NA, Pharmacia Biotech

Förvaras som pulver i rumstemperatur.


10x TBE-buffert, Karolinska sjukhuset (KS)

pH 8,0-8,4. SpÀds i H2O till lx TBE-buffert.

Förvaras i rumstemperatur.


Etidiumbromid (EtBr) KS

Koncentration: 10 mg/mL.

Förvaras i rumstemperatur.


6x Loading buffert, Scandinavian Diagnostic Services (SDS)

Blue orange loading buffert.

Förvaras vid 4 °C.


  • CNStabellbil8b.jpg


Provberedning inför 1:a amplifieringen

  • Frys likvor vid <=-18 °C.
  • Tina i rumstemperatur.
  • SĂ€tt 10 ÎŒL likvor till 0,5 mL PCR-rör i duplikat.
  • TillsĂ€tt 1 droppe (cirka 25 ÎŒL) mineralolja. StĂ€ng locket ordentligt.
  • Hetta upp likvorprovt i PCR-rören med olja i PCR-maskinen 95 °Ci—10 min.
  • De olika momenten i proceduren utförs pĂ„ fyra separata arbetsstationer för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.
  • Skriv analysprotokoll dĂ€r 1:a röret Ă€r en vattenkontroll och patientprov analyseras i duplikat. Vattenkontroller sĂ€tts mellan olika patientduplikat. Positiva kontroller sĂ€ttes sist.
  • Förbehandla likvor enil. provbehandling ovan (sĂ€ttningsbox).
  • Plocka fram reagenserna (ren plats) och blanda mastermix 1 i Eppendorfrör 1,5 mL.
  • SĂ€tt upp PCR-rör i still (sĂ€ttningsbox) inklusive de förbehandlade , provrören enligt analysprotokoll.
  • StĂ€ng rören och mĂ€rk locken med nummer enligt analysprotokoll Oppna ett rör i taget i nummerordning.
  • TillsĂ€tt 10 ÎŒL H20 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpĂ„
  • TillsĂ€tt 40 ÎŒL mastermix/rör under oljan.
  • StĂ€ng rören ordentligt.
  • SĂ€tt de positiva kontrollerna sist. Eventuella uppspĂ€dning& av positiva kontroller görs efter det att proven Ă€r satta och locken ordentligt tillsiutna.


1:a amp1ifieringen

Kör följande program:

5 min 92 °C

(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C I min)x20 cykler

1 min72°C

sök 4 °C


Provberedning inför 2:a amplifieringen

  • Gör Mastermix 2 med inre primers (ren plats).
  • SĂ€tt upp PCR-rör i stĂ€ll.
  • Fördela 47,5 ÎŒL mastermix/rör
  • TillsĂ€tt 1 droppe olja ovanpĂ„.
  • StĂ€ng locken och mĂ€rk locken med nummer enl. analysprotokoll.
  • Tag med rören till nestningsplats.
  • För över 2,5 ÎŒL prov frĂ„n 1:a steget till de nya rören.

Stor risk för kontamination, öppna dÀrför ett rör i taget.


2:a amplifieringen

Kör följande program:

5 min 92 °C

(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C 30Sek)X30 cykler

1 min 72 °C

Sök 4 °C


Elfores

  • Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 ÎŒg EtBr/mlL agaros i lx TBE-buffert. Gjut en gelform med kammar. LĂ€gg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 ÎŒg EtBr/mL TBEbuffert.
  • PĂ„ en remsa parafilm droppas 2 ÎŒL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 ÎŒL PCRprodukt. SĂ€tt 10 ÎŒL produkt/hĂ„l i gelen.
  • Starta aggregatet (140 V).
  • LĂ„t gelen gĂ„ i ca 20-30 min.
  • StĂ€ng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den pĂ„ UV-bordet.
  • Ta ett kort till analysprotokoflet


Bedömning

  • Analysen godkĂ€nns om 5 och/eller 10 fg av renat CMV DNA kan detekteras.
  • Kontrollera storleken av amplifikat jĂ€mfört med den positiva kontrollen.
  • Om bĂ€gge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsakad CNS-infektion
  • Om endast ena portionen blir positiv sĂ€tts provet om. Om fyndet kan repeteras svaras provet ut positivt, annars negativt.
  • Om oklarheter: SĂ€tt om provet, ev i spĂ€dning eller efter DNA-extration om det ger smear.