Bilaga 8 (CNS)
Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet
Bilaga 8
Cytomegalovirus. Detektion av CMV DNA med PCR-tekn;k enligt metod frÄn Sahlgrenska sjukhuset, Göteborg, modifierad vid Smittskyddsinstitutet
Provtagningsmaterial
CerebrospinalvÀtska (Csv)
Förvaras vid 4 °C eller -20 °C fram till transporten
Transport vid rumstemperatur
Apparatur
PCR-apparat (TC- 1, Perkin Elmer)
Variabla pipetter, fördelade pÄ arbetsstationer
Elektroforesutrustning
Polaroidkamera
UV-ljusbord
Förbrukningsmaterial
0,5 mL PCR-rör
1,5 mL Eppendorfrör
0,5-10 ÎŒL tippar utan filter
0,5-10 ÎŒL tippar med filter
10-200 ÎŒL tippar utan filter
100-1000 ÎŒL tippar utan filter
Reagens
H20: Sterilt vatten (dest.vatten) av hög renhetsgrad
Olja: Mineralolja, light
Primers: Pharmacia Biotech
Förvaras i -20 °C i Rena rummet
Koncentrationer:
1,4 ÎŒmol/L: CMVI och CMV2
2,8 ÎŒmol/L: CMV3 och CMV4
Samtliga primers Àr lokaliserade inom fjÀrde exonet av Major Immediate early gene (UL 122-123)
1:a amplifieringen
- CMV1 5â-GCG CCG CAT TGA GGA GAT CTG CAT-3â
- CMV2 5â-GAG CAC CCT CCT CCT crr CCT CAT-3â
Storlek pÄ PCR-fragment: 299 baspar
2:a amplifieringen
- CMV3 5â-GCC GAT CCT CTG AGA GTC TGC TCT C-3â
- CMV4 5â-CAG CCA CAA TIâA CTG AGG ACA GAG-3â
Storlek pÄ PCR-fragment: 191 baspar
10 x PCR buffert II, Perkin Elmer
Förvaras vid 4 °C.
MgCl2, Perkin Elmer
Koncentration: 15 mmol/L,
Förvaras vid 4 °C.
dNTP, Pharmacia Biotech
Koncentration: 2 mmol/L anvÀnds i en blandning av samtliga nukleotider.
Förvaras vid -20 °C.
Enzym, Perkin Elmer
Taq polymeras 5 U/ÎŒL
Förvaras vid -20 °C.
Agaros NA, Pharmacia Biotech
Förvaras som pulver i rumstemperatur.
10x TBE-buffert, Karolinska sjukhuset (KS)
pH 8,0-8,4. SpÀds i H2O till lx TBE-buffert.
Förvaras i rumstemperatur.
Etidiumbromid (EtBr) KS
Koncentration: 10 mg/mL.
Förvaras i rumstemperatur.
6x Loading buffert, Scandinavian Diagnostic Services (SDS)
Blue orange loading buffert.
Förvaras vid 4 °C.
Provberedning inför 1:a amplifieringen
- Frys likvor vid <=-18 °C.
- Tina i rumstemperatur.
- SĂ€tt 10 ÎŒL likvor till 0,5 mL PCR-rör i duplikat.
- TillsĂ€tt 1 droppe (cirka 25 ÎŒL) mineralolja. StĂ€ng locket ordentligt.
- Hetta upp likvorprovt i PCR-rören med olja i PCR-maskinen 95 °Ciâ10 min.
- De olika momenten i proceduren utförs pÄ fyra separata arbetsstationer för att minimera riskerna för kontamination av prov-DNA med amplifierad produkt.
- Skriv analysprotokoll dÀr 1:a röret Àr en vattenkontroll och patientprov analyseras i duplikat. Vattenkontroller sÀtts mellan olika patientduplikat. Positiva kontroller sÀttes sist.
- Förbehandla likvor enil. provbehandling ovan (sÀttningsbox).
- Plocka fram reagenserna (ren plats) och blanda mastermix 1 i Eppendorfrör 1,5 mL.
- SÀtt upp PCR-rör i still (sÀttningsbox) inklusive de förbehandlade , provrören enligt analysprotokoll.
- StÀng rören och mÀrk locken med nummer enligt analysprotokoll Oppna ett rör i taget i nummerordning.
- TillsĂ€tt 10 ÎŒL H20 till vattenkonltroll och en droppe olja ovanpĂ„
- TillsĂ€tt 40 ÎŒL mastermix/rör under oljan.
- StÀng rören ordentligt.
- SÀtt de positiva kontrollerna sist. Eventuella uppspÀdning& av positiva kontroller görs efter det att proven Àr satta och locken ordentligt tillsiutna.
1:a amp1ifieringen
Kör följande program:
5 min 92 °C
(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C I min)x20 cykler
1 min72°C
sök 4 °C
Provberedning inför 2:a amplifieringen
- Gör Mastermix 2 med inre primers (ren plats).
- SÀtt upp PCR-rör i stÀll.
- Fördela 47,5 ÎŒL mastermix/rör
- TillsÀtt 1 droppe olja ovanpÄ.
- StÀng locken och mÀrk locken med nummer enl. analysprotokoll.
- Tag med rören till nestningsplats.
- För över 2,5 ÎŒL prov frĂ„n 1:a steget till de nya rören.
Stor risk för kontamination, öppna dÀrför ett rör i taget.
2:a amplifieringen
Kör följande program:
5 min 92 °C
(94 °C 30 sek, 57 °C 30 sek, 72 °C 30Sek)X30 cykler
1 min 72 °C
Sök 4 °C
Elfores
- Gör i ordning 1,5 %-ig agaros med 0,5 ÎŒg EtBr/mlL agaros i lx TBE-buffert. Gjut en gelform med kammar. LĂ€gg ner den stela gelen i elektroforesbadet med 0,5 ÎŒg EtBr/mL TBEbuffert.
- PĂ„ en remsa parafilm droppas 2 ÎŒL 6x loadingbUffe1 och blandas med 10 ÎŒL PCRprodukt. SĂ€tt 10 ÎŒL produkt/hĂ„l i gelen.
- Starta aggregatet (140 V).
- LÄt gelen gÄ i ca 20-30 min.
- StÀng av aggregatet och ta upp gelen. Fotografera den pÄ UV-bordet.
- Ta ett kort till analysprotokoflet
Bedömning
- Analysen godkÀnns om 5 och/eller 10 fg av renat CMV DNA kan detekteras.
- Kontrollera storleken av amplifikat jÀmfört med den positiva kontrollen.
- Om bÀgge portionerna av likvorprovet blir positiva indikerar fyndet en CMV-orsakad CNS-infektion
- Om endast ena portionen blir positiv sÀtts provet om. Om fyndet kan repeteras svaras provet ut positivt, annars negativt.
- Om oklarheter: SÀtt om provet, ev i spÀdning eller efter DNA-extration om det ger smear.