Blododlingssystem

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Bakteriemi-diagnostik

---

Odlingssystem

Inledning

Ett idealiskt odlingssystem bör ha följande egenskaper:

• Ge snabb tillväxt med möjlighet till identifiering och resistensbestämning for samtliga mikroorganismer som kan vara av kliniskt intresse.
• Ge möjlighet till objektiv och snabb detektion.
• Tillåta odling av tillräckligt stor blodvolym.
• Neutralisera bakteriehämmande substanser från blodet.
• Minimera risken för nosokomial smitta.
• Erbjuda god arbetsergonomi.
• Kräva låga kapital- och driftskostnader.

Metodöversikt

• 1. Bifasiskt system med buljong/agar i ständig kontakt (referensmetod). Det bifasiska systemet som av tradition använts i Sverige, är enkelt och tillgängligt för alla laboratorier, och har valts som referensmetod.
• 2. Bifasiskt system med möjlighet till inokulering från buljong till agaryta.
• 3. Buljong med visuell avläsning.
• 4. Buljong med detektion genom förhöjt gastryck.
• 5. Buljong med detektion av reducerat hemoglobin.
• 6. Buljong med direkt CO₂-detektion genom IR-teknik/isotopteknik.
• 7. Buljong med indirekt CO₂-detektion genom kolorimetrilfluorimetri.
• 8. Lysis-filtrering och utodling på agarplattor.
• 9. Lysis-centrifugering och utodling på agarplattor.
• 10. Elektrisk impedansmätning i buljong.
• 11. Ingjutning i agar.

1. Bifasiskt system med agar och buljong i ständig kontakt (referensmetod)

Väldokumenterad teknik. Flaskorna kan framställas vid större laboratorier, kräver ingen avläsningsutrustning och är kommersiellt tillgängliga. Systemet utvecklades ursprungligen av Castañeda för diagnostik av Brucella-infektioner. Agarn är i ständig kontakt med buljongen och blir dessutom inokulerad då flaskan vänds. Fagocyter adhererar till agarn och desintegreras varvid intracellulära bakterier frigörs och kan bilda kolonier på agarn. Flertalet bakteriearter och jästsvamp växer fram och fortsatt undersökning med mikroskopi, art- och resistensbestämning kan enkelt ske från agarytan. Samtidig växt av mer än en bakterieart kan upptäckas.

• Nackdelar är en ergonomiskt ogynnsam manuell hantering och visuell avläsning. Systemet är ej anpassat för vakuumprovtagning.

2. Bifasiskt system med möjlighet till inokulering från buljong till agaryta

Väldokumenterad teknik. Kommersiellt tillgänglig (Septi-Chek, Roche; Vacutainer Brand Agar Slant, Opticult Becton Dickinson) och anpassad för vakuumprovtagning.

När blodprov i flaska med anrikningsbuljong kommer till laboratoriet öppnas flaskan och en kammare med agaryta skruvas fast på buljongflaskan. Flaskan kan därefter vändas så att blod-buljongblandningen inokulerar agarytan.

• Fördelar. Framväxta bakterier lätt åtkomliga för fortsatt undersökning. I övrigt jämförbart med system 1.

• Nackdelar. Inokulering av agarn sker först när odlingsflaskan kommit till laboratoriet. När flaskan öppnas och agarkammaren skruvas på finns möjligheter till kontamination med falskt positivt resultat som följd. I övrigt jämförbart med system 1.

3. Buljong med visuell avläsning

Väl dokumenterad teknik. Flera kommersiella tillverkare finns (ex Vacutainer, BectonDickinson).

Den enklaste och internationellt mest använda metoden för blododling. Utgörs av näringsbuljong med olika tillsatser och olika gasmiljö. Bakterieväxten bedöms visuellt genom grumlighet men utodling till agarplattor sker vanligen efter ett dygn även om ingen grumlighet syns. Anpassad för vakuumprovtagning.

• Fördelar. Enkel och billig tillverkning. Ett flertal varianter av buljong och tillsatser kommersiellt tillgängliga. Egen tillverkning möjlig.

• Nackdelar. Det kan vara svårt att se bakterieväxt. Utodling rekommenderas därför av samtliga flaskor eller på mycket vida indikationer. Ventilering av flaskorna viktig för optimal isoleringsfrekvens av jästsvamp.

4. Buljong med detektion genom förhöjt gastryck

Kommersiellt tillgänglig (Signal, Oxoid). Bakterieväxten ger ett övertryck och buljongen är komponerad så att den metaboliska effekten produceras av såväl aeroba som anaeroba bakterier. Övertrycket gör att buljongen stiger upp i en behållare, Signalen, som sätts på buljongflaskan efter det att blodet är tillsatt. Från buljongen i den positiva Signalen görs mikroskopiska preparat och subkulturer. Förberett för vakuumprovtagning.

• Fördelar. En buljongflaska för både aerober och anaerober. Positiv odling lätt avläsbar. Framväxta bakterier lätt åtkomliga för fortsatt undersökning.

• Nackdelar. Bakterier med låg metabolism signalerar ej, ex. Corynebacterium jeikeium. Bakterier som behöver tillväxtfaktorer såsom Haemophilus influenzae och meningokocker signalerar sent och svagt. Jästsvamp behöver lång tillväxttid, 6 - 7 dagar.

5. Buljong med detektion av reducerat hemoglobin

Kommersiellt tillgänglig och dokumenterad (Statens seruminstitut, Köpenhamn). Genom kraftig skakning (275 rpm) under första dygnet i aeroba flaskor åstadkomms en snabb bakterietillväxt och syrekonsumtion. Oxyhemoglobin i blodet från det tillförda provet reduceras och färgen ändras från ljusröd till mörkröd-svart.

• Fördelar. Kräver förutom skakbord ingen dyrbar kringutrustning. Systemet är anpassat för vakuumprovtagning.

• Nackdelar. Begränsad praktisk erfarenhet.

6. Buljong med detektion av CO₂ genom IR- eller isotopteknik

Väl dokumenterad teknik. Kommersiellt tillgänglig (Bactec, Becton Dickinson). Ökad CO₂- halt i odlingsflaskans gasfas orsakad av bakteriemetabolism indikeras automatiskt med hjälp av infraröd-spektrofotometer. De med blod inokulerade flaskorna inkuberas de första dygnen under kontinuerlig skakning och avläses under de första dagarna två - tre gånger per dygn. Beroende på graden av datoriserad utrustning larmar systemet vid ett förutbestämt gränsvärde eller vid ett gränsvärde baserat på totalhalt och/eller på skillnaden mellan två konsekutiva mätningar. Vid varje mättillfälle byts hela gasfasen i odlingsflaskan till en specificerad gas (aerob respektive anaerob). I det mest datoriserade systemet registreras resultaten automatiskt och per patient. Det finns flera olika medier att välja mellan t ex med resin (antibiotikaabsorbent) eller särskilt för svamp. Systemet är anpassat för vakuumprovtagning.

För TB-diagnostik används motsvarande metod men med $^1$$^4$CO₂-bestämning.

• Fördelar. Skakningen av flaskorna påskyndar bakterietillväxten. Ergonomiskt bra system.

• Nackdelar. Kräver dyr avläsningsutrustning. Höga driftskostnader. Vissa leukemifall med hög celltäthet i blodet kan ge falskt positiva resultat.

7. Buljong med indirekt CO₂-detektion genom kolorimetri eller fluorescensteknik

Kommersiellt tillgänglig och dokumenterad (Bactec, BectonDickinson; BacTalert, Organon). Helt slutet automatiskt system för detektion av bakterieväxt. Utveckling av CO₂ mäts utifrån genom kolorimetrisk eller fluorimetrisk sensor separat för varje flaska. Anpassat för vakuumprovtagning.

• Fördelar. Kontinuerlig automatisk avläsning med larm för växt m m. Ergonomiskt och användarvänligt system.

• Nackdelar. Begränsad praktisk erfarenhet. Dyrbar utrustning. Höga driftskostnader. Leukemipatienter kan ge falskt positiva resultat.

8. Lysis-centrifugering och utodling på agarplattor

Väl dokumenterad teknik. Kommersielft tillgänglig (Isolator DuPont) Blod uppsamlas i särskilda rör, med tillsats för lysering av blodkropparna. Rören centrifugeras , och eventuella bakterier fångas upp av en i röret placerad inert “kudde”. Kudden tas ut och odlas på lämplig näringsagar. Anpassat för vakuumprovtagning.

• Fördelar. Fagocyter lyseras. Bakteriehämmande substanser avlägsnas. Ökar möjligheterna att isolera Staphylococcus aureus, Pseudomonas och jästsvamp. Tillåter kvantitering av bakteriehalten i blodet.

• Nackdelar. Arbetskrävande. Centrifugering och utodling måste ske inom nio timmar efter provtagningen. Risk för kontamination under upparbetningen.

9. Lysis-filtrering och utodling på agarplattor

Finns ej som kommersiellt system. Används ej rutinmässigt. Efter lysering av blodkropparna fitreras blodet genom ett bakterietätt filter. Filtret läggs på önskad typ av näringsagar och eventuella bakterier får växa fram.

10. Elektrisk impedansmätning i buljong

Kommersiellt tillgänglig (Malthus, England). Bakterieväxt i buljong förändrar impedansen proportionellt till bakteriemängden. Används inom vatten- och livsmedelsbakteriologin. Kräver dyrbara elektroder (platina, rostfritt specialstål) som sitter i flaskans gummipropp.

11. Ingjutning i agar med utodling på agar som variant

Äldre metod som ej längre används rutinmässigt. 1 - 2 mL av det blodprov som ska undersökas blandas med smält agar och gjutes i petriskål. Alternativt utodlas provet direkt på lämplig yta.