CNS-infektioner-metoder för evaluering av specifikt immunsvar

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet



Metoder för evaluering av specifikt immunsvar i CNS

Bakgrund

Relativt lite Àr kÀnt om immunologiskt aktiva celler i hjÀrnan. Möjligen kan mikroglia ha makrofagfunktion, och astrocyter liksom endoteliala celler kan spela roll vid antigenpresentation. Blodceller kan passera över till hjÀrnan, och inflammatoriska celler som hittas vid sjukliga processer kommer frÄn blodet. Hos friska personer hittas endast lymfocyter och monocyter i CNS, medan fynd av polymorfkÀmiga leukocyter alltid Àr patologiskt.

De mjuka hinnorna i CNS har en barriÀrfunktion (blood-brain-barrier, BBB) som gör att en mycket liten del serumproteiner passerar till likvorrummet. Möjligheten till passage minskar ju större och ju mera negativt laddat ett protein Àr. IgG och IgA passerar av bÄda dessa skÀl lÀttare över till likvor Àn IgM. Normalrelationen mellan proteinkoncentration i serum och likvor kan variera kraftigt, och vid olika studier har olika normalgrÀnser angivits. Likvorkoncentrationen av IgG och IgA Àr grovt sett 0,2-0,4% av serumkoncentrationen, och för IgM Àr den Ànnu lÀgre.

Vid infektion i CNS ökar i de flesta fall proteinlÀckaget över BBB. Olika typer av leukocyter vandrar in frÄn blodet, och eliminerar med sina olika effektormekanismer infektiöst agens eller infekterade celler. Invandringen av leukocyter speglas av cellfynden i likvor. B-celler Àr den celltyp som upptrÀder i CNS senast i sjukdomsförloppet. Specificiteten och aktiviteten av immunologiskt primade T- och B-celler kan mÀtas in vitro genom lymfocytstimulering, analys av cytokinaktivitet, mÀtning av specifik antikroppsproduktion frÄn stimulerade B-celler och tester för specifik cytotoxisk aktivitet. Dessa tester anvÀnds Ànnu bara i forskningssyfte. MÀtning av vissa cytokiner i likvor sÄsom alfa-interferon anges kunna vara av diagnostiskt vÀrde, och kan komma att inkluderas vid rutinundersökningar av likvorprov vid de kemiska laboratorierna i framtiden.

Om B-celler frÄn blodet stimuleras till intratekal antikroppsproduktion genom antigenpresentation inom CNS kan man i likvor fÄ en i relation till serumkoncentrationen större mÀngd specifika antikroppar mot presenterat agens. Förekomst av intratekal antikroppsproduktion Àr ett tecken pÄ immunsvar inom CNS mot ett agens, och anses vara en sÀker markör för att detta orsakat sjukdom. Ett undantag Àr MS-patienter, som ofta har intratekal antikroppsproduktion mot ett antal virus utan att man dÀrför har pÄvisat nÄgot etiologisk samband mellan dessa virus och MS. Om MS uteslutits, vilket i de flesta fall Àr relativt lÀtt, brukar pÄvisande av intratekal antikroppsproduktion mot ett agens anses vara diagnostiskt för pÄgÄende/genomgÄngen infektion. Antikropparna kan mÀtas mycket lÀnge ( 18 Är har beskrivits för herpes simplex), varför aktualiteten av infektionen inte kan avgöras av ett intratekalt IgG-svar.

Specifika intratekal antikroppar hittas ofta inte förrÀn 5 dagar efter insjuknandet. Detta innebÀr att pÄvisande av intratekal antikroppsproduktion har ett begrÀnsat vÀrde i akutskedet av en CNS-sjukdom. MÀtning Àr dÀremot mycket vÀrdefullt nÀr man vill verifiera osÀkra akutfynd eller inte lyckats uppnÄ diagnos i akutprov.

Att fastÀlla att antikroppar verkligen producerats inom CNS och inte Àr passivt överförda frÄn blod kan vara mycket svÄrt. En rad metoder har föreslagits för att sÀkerstÀlla detta. Kortfattade beskrivningar av de mest vÀletablerade metoderna följer nedan.

Metoder för faststÀllande av specifik, intratekal antikroppsproduktion

  • 1. Gelseparation med immunfixation eller immunoblotting:

BÄde serum och likvor mÄste undersökas samtidigt. MÀngden av den isotyp av antikropp som skall mÀtas justeras, sÄ att lika stor mÀngd IgG frÄn serum respektive likvor analyseras. Serum och likvor IgG separeras i band med elektrofores, eller isoelektrisk fokusering. Vid immunfixation inkuberas gelen med antigen. Antikroppar som inte bildat komplex med antigen sköljs bort. Vid immunoblotting fÄngas separerade specifika antikroppar pÄ membraner eller geler, som mÀttats med relevant antigen. För att hitta de specifika banden anvÀnds anti-antikroppar mÀrkta med exempelvis radioaktivitet eller peroxidas. Efter framkallning jÀmförs mönstret i likvor och serum. Band av specifika antikroppar som finns i likvor, men inte i serum, anses vara ett sÀkert tecken pÄ specifik intratekal produktion av en antikropp. Intensiteten av ett band kan ocksÄ avlÀsas med exempelvis densitometri, och jÀmförelsevis starkare band i serum Àn i likvor kan indikera intratekal antikroppsproduktion.

  • 2. Indexmetoder

Gelseparationsmetoderna anses ofta vara de mest kÀnsliga och specifika testerna för pÄvisande av intratekala antikroppar, men Àr ofta tidsödande och materialkrÀvande. Vid de mikrobiologiska laboratorierna anvÀnds i stÀllet kÀnsliga metoder, sÄsom ELISA, för mÀtning av specifika antikroppar av olika isotyp. MÀngden antikroppar i serum eller likvor uttrycks med titer, absorbansvÀrde x spÀdningsfaktor eller arbitrÀra enheter i förhÄllande till en standard. Ett ratio, index, mellan likvormÀngd och serummÀngd av specifika antikroppar berÀknas. Detta divideras i sin tur med likvor/serum index för totalmÀngd IgG eller albumin, för att korrigera för lÀckage över blod-hjÀrnbarriÀren. Man kan ocksÄ undersöka spÀdningar av serum och likvor innehÄllande samma IgG-, IgA- eller IgM-mÀngd. För alla olika tekniska lösningar finns grÀnsvÀrden för patologiska antikroppsindex utrÀknade (tabell 10).

De ovan nÀmnda indexmetoderna krÀver att laboratoriet kÀnner till total- mÀngden av den Ig-isotyp som ska analyseras, eller av albumin. Med capture-teknik, dÀr brunnarna coatas i en ELISA-platta med anti-isotyp, kan man fÄnga upp lika stor mÀngd antikropp frÄn sÄvÀl serum som likvor. EnzymmÀrkt antigen tillsÀtts dÀrefter. Om substratreaktionen ger högre absorbans i likvor Àn i serum föreligger intratekal antikroppsproduktion. I en annan metod undersöks parallellt antikroppar i serum och likvor mot flera antigen som coatats pÄ en ELISA-platta. Det Àr lÀmpligt att inkludera exempelvis mÀssling och varicella, mot vilka de flesta mÀnniskor har antikroppar. Man jÀmför sedan absorbans eller titerindex mellan serum och likvor för de olika antigenerna. Om ett ratio Àr signifikant lÀgre Àn de andra föreligger intratekal antikroppsproduktion. Det Àr viktigt att samma spÀdningar av serum och likvor undersöks i samma test, dÄ systemet Àr mycket kÀnsligt för inter-assay variation.

TotalmÀngd av IgG, andra isotyper eller albumin mÀts sÀllan i samband med akuta CNS-infektioner. De sistnÀmnda undersökningsmetoderna lÀmpar sig dÀrför bÀst vid de mikrobiologiska laboratoriema. EnzymmÀrkta antigener kan vara svÄra att producera och lagerhÄlla, medan den indirekta metoden tillÄter anvÀndande av mera lÀttillgÀngliga, omÀrkta antigen.

CNStabell10.jpg


REFERENSER

  • Boucquey D, Chalon M-P, Sindic CJM, Lamy ME, Laterre C. Herpes simplex virus type 2 meningitis without genital lesions: an immunoblot study. J Neurol 1990;237:285-289.
  • Hansen K, Cruz M, Link H. Oligocional Borrelia burgdorferi-specific IgG antibodies in cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis. J Infect Dis 1990; 161:1194-1202.
  • Kaiser R, Liicking C-H. Intrathecal synthesis of specific antibodies in neuroborreliosis. Comparison of different ELISA techniques and calculation methods. J Neurol Sci 1993;118:64-72.
  • Klapper PE, Laing L, Jongson M. Rapid non-invasive diagnosis of herpes encephalitis. Lancet ii 1981;607-609.
  • Luxton RW, McL.ean BN, Thompson EJ. Isoelectric focusing versus quantitative measurements in the detection of intrathecal local synthesis of IgG. Clin-Chim-Acta 1990;187:297-308.
  • Mathiesen T, Fridell E, Fredrikson S, Linde A, Sundqvist V-A, Edler D, Wahren B. Combination ELISA for antiviral antibodies in CSF and serum in patients with neurological symptoms and in healthy controls. J Virol Meth 1988;19:169-180.
  • Pohi-Koppe A, Dahm C, Elgas M, Kuhn JE, Braun RW, ter Meulen V. The diagnostic significance of the polymerase chain reaction and isoelectric focusing in herpes simplex virus encephalitis. J Med Virol 1992;36:147-154.
  • Rehse-KĂŒpper B, Ackermann R. Demonstration of intrathecally synthesized Borrelia antibodies in cerebrospinal fluid. Z Bakt Hyg 1986;A263:407-411.
  • Reiber H, Lange P. Quantitation of virus-specific antibodies in cerebrospinal fluid and serum: sensitive and specific detection of antibody synthesis in brain. Clin Chem 1991;37:1153-1160.
  • Sharief-MK, Keir G, Thompson EJ. Intrathecal synthesis of IgM in neurological diseases: a comparison between detection of oligocional bands and quantitative estimation. J Neurol Sci 1990;9:131-142.
  • Sindic CJM, Monteyne Ph, Laterre EC. The intrathecal synthesis of virus-specific oligocional IgG antibodies in multiple scierosis. J Neuroimmunol 1994;54:75-80.
  • Souverijn JH, Serree HM, Peet R, Grenzebach-Smit W, Bruyn GW. Intrathecal immunoglobulin synthesis. Comparison of various formulae with the ‘gold standard’ of isoelectric focusing. J Neurol Sci 1991;102:11-16.