PAR 09 Malariamikroskopi

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel, publicerad april 2012.


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik

och Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar med FolkhÀlsomyndighetens falldefinition i artikeln Malaria


Mikroskopisk pÄvisning av malariaparasiter

Analysprincip/teststrategi

Tjock droppe

NĂ„gra droppar blod rörs ut pĂ„ ett objektglas och fĂ„r torka. FĂ€rgas utan föregĂ„ende fixering med buffrad Giemsalösning alternativt med Field’s stain varvid erytrocyterna hemolyserar. Glaset sköljs försiktigt, fĂ„r torka och granskas i ljusmikroskop. Malariaplasmodiernas kĂ€rna fĂ€rgas röd och deras cytoplasma blĂ„. Tjock droppe anvĂ€nds frĂ€mst för att pĂ„visa förekomst av malariaplasmodier.

Tunt utstryk

En droppe blod stryks ut pÄ objektglas, fÄr torka, metanolfixeras och fÀrgas med Giemsa-lösning. Tunt utstryk anvÀnds frÀmst för att bestÀmma species vid positiva fynd samt för rÀkning av antalet infekterade erytrocyter.

Provmaterial

Tjock droppe och utstryk pÄ objektglas eller nytaget EDTA-blod. EDTA-blod bör inte vara Àldre Àn 6 timmar. Heparinblod accepteras inte.

Provtransport

Malaria-mikroskopi Àr vanligtvis ett akutprov och provtagning sker lÀmpligen pÄ infektionsklinik dÀr det finns möjlighet att utföra mikroskopi lokalt (alternativt snabb transport till ett parasitlaboratorium). Om det blir aktuellt att skicka prov med lÀngre transporttid Àn nÄgra timmar skall tjock droppe och utstryk göras frÄn EDTA-blod. Preparat som Àr helt torra lÀggs i transporthylsa för objektglas. Observera att det Àr mycket viktigt att tjocka droppen fÄtt torka helt innan den lÀggs i transporthylsan.

Speciell utrustning

DragskÄp alternativt dragbÀnk

Ljusmikroskop med immersionsobjektiv 100x och 50x

Reagenser

  • metanol 99,8%
  • Giemsa stocklösning (Giemsa azur-eosin-metylenblĂ„ lösning)
  • fosfatbuffert pH 7,2 (enligt ref 2)
di-NatriumvÀtefosfat Na2HPO4 1,0 g
kaliumdivÀtefosfat KH2PO4 0,7 g
destillerat vatten till 1000 mL
Kontrollera pH.
  • Field's stain A (MetylenblĂ„tt-azur)
  • Field's stain B (Eosin)
Field's stain A och B finns att köpa t ex frÄn DiaSys Ltd i England
  • Immersionsolja för ljusmikroskopi

Analysprocedur

Beredning av tjock droppe och tunt utstryk görs pÄ nytaget EDTA-blod. Arbetet utförs i sÀkerhetsbÀnk. AnvÀnd handskar. Blanda EDTA-röret noggrant och mÀrk 4 objektglas med mattfÀlt med provnummer.

Tjock droppe

1. Sug upp en droppe blod (10 ”L). LÀgg droppen mitt pÄ ett objektglas. Rör ut droppen till ca 1,5 cm i diameter. Gör dubbelprov.

2. LÄt torka minst 60 min i rumstemperatur eller 5-15 min i vÀrmeskÄp (37° C).

Tunt utstryk

1. SÀtt en liten droppe blod (ca 5 ”L) vid mattkanten pÄ ett objektglas. HÄll ett utstryksglas mot droppen och nÀr den spridit sig efter hela kanten förs utstryksglaset över objektglaset sÄ att ett tunt utstryk bildas. Gör dubbelprov.

2. LĂ„t torka i rumstemperarur.

FĂ€rgning

Arbetet utförs i dragskÄp eller dragbÀnk.

Alternativ 1: FĂ€rgning med Giemsa

AnvĂ€nd nyberedd Giemsa-lösning vid varje fĂ€rgningstillfĂ€lle. SpĂ€d till 5–10 % med fosfatbuffert pH 7,2. Se under anmĂ€rkning.

Tjock droppe

OBS! Tjock droppe fÀrgas ofixerad.

1. LĂ€gg objektglaset pĂ„ ett fĂ€rgningsstĂ€ll. TĂ€ck glaset med Giemsa-lösning. FĂ€rga 10–20 minuter.

2. Skölj av fÀrglösningen mycket försiktigt i en bÀgare med kranvatten alternativt under svagt rinnande vatten. OBS! Rikta aldrig vattenstrÄlen direkt mot tjocka droppen.

3. LÄt torka stÄende.

Tunt utstryk

1. Fixera tunt utstryk ca 30 sekunder i absolut metanol (kyvett i dragbÀnk eller dragskÄp).

2. LĂ„t lufttorka.

3. LĂ€gg objektglaset pĂ„ ett fĂ€rgningsstĂ€ll. TĂ€ck glaset med Giemsa-lösning. FĂ€rga 10–20 minuter. Se under anmĂ€rkning.

4. Skölj vÀl i kranvatten.

5. LÄt torka stÄende.

AnmÀrkning GiemsafÀrgning

Styrka och tid för GiemsafÀrgning varierar stort i olika publikationer. Det Àr dÀrför viktigt att testa ut optimal koncentration och tid för det egna behovet. Generellt gÀller att ju högre koncentration av GiemsafÀrg man anvÀnder desto kortare fÀrgningstid.

Alternativ 2: FĂ€rgning med Field’s stain (modifierat efter ref 3)

Tjock droppe

Gör iordning 2 kyvetter med lock: en med Field’s stain A och en med Field’s stain B. InnehĂ„llet i kyvetterna byts var 14:e dag.

1. Doppa objektglaset i kyvett A i 5 sekunder. Erytrocyterna hemolyserar.

2. Skölj av fÀrglösningen försiktigt i en bÀgare med svagt rinnande kranvatten.

OBS! Rikta aldrig vattenstrÄlen direkt mot tjocka droppen.

3. Doppa glaset i Field’s stain B i 4–5 sekunder.

4. Skölj av fÀrglösningen försiktigt i en bÀgare med svagt rinnande kranvatten.

OBS! Rikta aldrig vattenstrÄlen direkt mot tjocka droppen.

5. LÄt torka stÄende.

Tunt utstryk

FĂ€rgning av tunt utstryk med Field’s stain kan utföras om snabb identifiering av species önska. I förekommande fall rekommenderas kompletterande fĂ€rgning med Giemsa. AnvĂ€nd nyberedd Field’s stain B spĂ€dd 1+3 med fosfatbuffert vid varje fĂ€rgningstillfĂ€lle.

1. Fixera utstryket 30 sekunder i metanol (kyvett i dragbÀnk eller dragskÄp).

2. LĂ„t utstryket lufttorka.

3. LĂ€gg glaset pĂ„ ett fĂ€rgningsstĂ€ll. LĂ„t 1 ml Field’s stain B spĂ€dd 1+3 med fosfatbuffert flöda över preparatet.

4. 1 mL av ospĂ€dd Field’s stain A sĂ€tts till och blandas genast med lösning B.

5. FĂ€rga 1 minut.

6. Skölj vÀl i kranvatten.

7. LÄt torka stÄende.

Bedömning av prov

Granskning av tjock droppe

Malariaplasmodier pÄvisas i tjock droppe. Hela droppen kan initialt screenas med objektiv 50x och misstÀnkta objekt verifieras med 100x. Minst 200 synfÀlt skall observeras med objektiv 100x innan provet bedöms som negativt.

Granskning av tunt utstryk

Plasmodiernas utseende i tunt utstryk i kombination med utseendet i tjock droppe ligger till grund för typning av malariaspecies.

RĂ€kning av antal malariaplasmodier i tunt utstryk

Vid positivt prov som innehĂ„ller trofozoitformer av Plasmodium falciparum skall det procentuella antalet infekterade erytrocyter rĂ€knas i tunt utstryk. Se under rubrik ”RĂ€kning av antalet malaria-infekterade erytrocyter i tunt utstryk".

KvalitetssÀkring

Intern

Leukocyternas utseende observeras i varje preparat. PÄ sÄ sÀtt blir varje preparat sin egen internkontroll. För bildmaterial se (ref. 4, 5, 6, 7). Referens 6 innefattar Àven Plasmodium knowlesi .

Internt referensmaterial: Panel bestÄende av sparade interna positiva preparat samt preparat frÄn UK-NEQAS

Extern

Malariaparasiter ingÄr i UK-NEQAS blodutskick.

Prestanda

Vid granskning av 200 synfÀlt med objektiv 100x (motsvarar ca 0,2 ”L blod) i tjock droppe blir kÀnsligheten cirka 15 parasiter per ”L (ref 8). Specificiteten Àr vanligtvis hög, men kan vara relativt lÄg vid mycket lÄga parasitemier samt vid blandinfektion, speciellt nÀr en Plasmodium-art övervÀger. Se ocksÄ nedan under svarsrutin för P. malariae/P. knowlesi.

Svarsrutin

Negativt prov

Inga malariaplasmodier pÄvisade.

Positivt prov

Malariaplasmodier pÄvisade. Ange species och utvecklingsstadium (d.v.s. skilj pÄ sexuella och asexuella former).

  • Ex 1: Ringformer av Plasmodium falciparum (ange dessutom alltid parasitemi i % av infekterade erytrocyter)
  • Ex 2: Alla former av Plasmodium vivax
  • Ex 3. Gametocyter av Plasmodium falciparum pĂ„visade.

Om artbestÀmning inte Àr möjlig: Enstaka malariaplasmodier pÄvisade i tjock droppe. ArtbestÀmning inte möjlig p. g. a. av lÄg parasitemi.

Observera att det morfologiskt inte gÄr att skilja P. malariae frÄn P. knowlesi. I förekommande fall (patienter frÄn omrÄden dÀr bÄda species förekommer) skall detta framgÄ av svaret, samt att PCR rekommenderas för artbestÀmning.

LitteraturhÀnvisningar

1. Shute GT. The microscopic diagnosis of malaria. In Malaria, Principles and Practice of Malariology. Ed WH Wernsdorfer and J Mc Gregor. London Churchill Livingstone 1988;781-814.

2. http://www.wpro.who.int/NR/rdonlyres/CFD9EFCC-A0F8-425E-85D7-D65C1B050934/0/Malaria_malaria_microscopy_Learners_guide2010.pdf

3.http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Blood_Scheme/Teaching_Information/Stains_for_malaria_parasites/stains_for_malaria_parasites.html

4. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.

5. WHO Bench Aids for the Diagnosis of Malaria Infections.

6. http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/imagelibrary/malaria_il.htm

7. Chiodini PL, Moody AH, Manser DW. Atlas of Medical Helminthology and Protozoology. Harcourt Publishers, Churchill Livingstone. http://www.mediafire.com/?zmmtoehumz2

8. Hellgren U, Ericsson Ö, Kihamia CM, Rombo L. Malaria parasites and chloroquine concentrations in Tanzanian school children. Trop Med Parasitol 1994;45:293-297.

 

RĂ€kning av antalet malaria-infekterade erytrocyter i tunt utstryk

Speciell utrustnĂ­ng

Mikroskop med rÀkneokular

Arbetsprocedur

1. VÀlj ett omrÄde i ett Giemsa-fÀrgat tunt utstryk dÀr erytrocyterna ligger jÀmnt fördelade.

2. Den inre lilla rutan utgör en tiondel av den yttre rutan. RÀkna alla erytrocyter inuti den inre rutan samt de som finns pÄ tvÄ av sidolinjerna av den inre rutan.

Dok1.jpg

3. RÀkna samtidigt antalet infekterade erytrocyter i den stora rutan plus tvÄ kanter. RÀkna Àven med den lilla inre rutan.

4. FortsĂ€tt i preparatet enligt punkt 2 och 3 tills 300–500 erytrocyter i lilla rutan Ă€r rĂ€knade. DĂ„ Ă€r 3000–5000 erytrocyter granskade med avseende pĂ„ parasiter.

5. UtrĂ€kning: Antal infekterade erytrocyter x 100/Antal granskade erytrocyter = % infekterade erytrocyter.

RÀkneexempel: Du har rÀknat till 450 erytrocyter i den inre rutan. Detta innebÀr att 4500 erytrocyter Àr granskade. Du har samtidigt rÀknat till 80 infekterade erytrocyter i hela stora rutan inklusive den inre.

UtrĂ€kning: 80 x 100/4500=1,8 % infekterade erytrocyter

OBS! Om en erytrocyt innehÄller 2 plasmodier rÀknas den fortfarande som en infekterad erytrocyt.

Utsvar: x % erytrocyter infekterade med Plasmodium falciparum.

LitteraturhÀnvisningar

Carl Zeiss Svenska AB: InstÀllbart okular med okularstreckplatta för retikulocytrÀkning.