Bilaga 1b. Substratkontroll

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

Bilaga 1.b

Substratkontroll

Ett stort antal olika odlingsmedia för primär isolering av tarmpatogener finns kommersiellt tillgängliga. Dessa är regelmässigt noggrant kvali­tetskontrollerade av producenten, vilka på begäran bifogar analys­certi­fikat över aktuell lot. Detta innehåller uppgifter bl.a. om komposition, fysikaliska egenskaper, od­lingsegen­skaper med olika referensstammar, förvaring etc. enligt tillgängliga standarder, exempelvis NCCLS Doc M22-A. Trots detta föreligger skillnader mellan olika fabrikat av samma medium. Dessa skillnader kan avseende såväl selektiva som dif­ferentierande egenskaper uppnå statistisk signifikans, och därvid spela roll för diagnostiken. Vidare förekommer även vissa variationer mellan tillverknings­loter (batcher) av samma fabrikat, de senare sannolikt större ju mindre väldefi­nierat sub­stratet är. Detta innebär att tillgängliga kommersiella halvfabrikat kan variera avseende diagnostisk för­måga, beroende på skillnader i såväl selektiva som differentierande egenska­per. Vid det enskilda labo­ratoriet är sedan varia­tioner vid den fort­löpande tillverkningen inom en och samma lot oundvikliga.

Testförfarande inför upphandling av fasta substrat, referensmetod

Inför upphandling av selektiva fecessubstrat (beskrivningen avser i första hand DC-Hynes, XLD, Hektoen och CIN-agarmedier) skall jäm­förelse göras mellan pågående lot och prov från nya loter från en eller flera leverantörer. Loterna jämförs med avseende på selektiv och diffe­rentierande förmåga. En av loterna väljs därefter.

Den selektiva förmågan bedöms genom att studera växt av målbakte­rier och inhibition av normalflorans bakterier i jämförelse med växt på icke inhiberande kontrollsubstrat (uttrycks för vardera bakterieart som relative growth index, se definition nedan). Lämpligt koloniantal för målbakterier är ca $10^{2}$, vilket mot­svarar ett bakterietal som är vanligt i den diagnostiska situationen (motsvarar ca $10^{4}$-$10^{5}$ bakterier/g fe­ces). Koloniantalet är också lämpligt för att minimera de statistiska följderna av tekniska variationer. Den differentierande förmågan studeras ge­nom att bedöma parametrarna kolonidiameter, allmänt kolo­ni­ut­seende (opak, semiopak eller genomskinlig, slät eller rå, konvex eller platt, blank eller matt) och ko­lonifärg (färglös, d.v.s. lika substratet, rosa/röd, gul/vit, svart, grått eller rött kolonicentrum och ev. omslag i mediet samt andra ev. no­tabla karakteristika).

Beträffande val av stammar för testningen är minimikravet att ur referens­stams­panelerna (se under re­spektive patogen för målbakterier och nedan för kontami­nantstammar för val och förväntat resultat) testa minst två Salmonella-, Shigella- och Yersinia-stammar samt E. coli CCUG 17 620 och E. coli CCUG 30 600 (gäller XLD, Hektoen och DC-Hynes) eller två Yersinia-stammar, E. coli enlig ovan och Citro­bacter braakii CCUG 41766 (gäller CIN-agar). Principen är att utmana substraten med renkulturer av ”normala” stamtyper men också sådana målbakterier som växer dåligt och sådana kontaminanter som ofta för­mår växa på selektiva substrat.

Utförande:

• 1. Slamma kolonier av utväxta bakterier från en agaryta (t.ex. blod) i 5 mL peptonbuljong med 1 % hästserum. Inkubera övernatt i 35 °C-37 °C.
• 2. Tvätta lagfaskulturerna x2 i PBS.
• 3. Späd bakteriekulturer i PBS till Mc Farland Standard 1 och sedan ned till motsvarande ca $10^{2}$ CFU/50 µL. Kontaminantkulturer späds ned till motsvarande ca 2x$10^{3}$ CFU/50 µL för att uppnå högre bakterietal på kontrollagarplattorna. Observera dock att vissa kontaminanter kräver samma spädning som målbakteriena.
• 4. Inokulera plattorna (testagar och kontrollagarplattor, som kontrol­lagar används CLED eller MacConkey) med vardera 50 µL i duplikat (eller triplikat) och sprid jämt över agarytan med rackla eller sterila glaskulor.
• 5. Inkubera övernatt i 35 °C - 37 °C (CIN-agar i 28 °C - 30 °C).
• 6. Räkna antalet kolonier. Vid ingen eller mycket svag växt inkube­ras plattorna ytterligare ett dygn (gäller i första hand DC-Hynes). Koloniantalet bör vara ca $10^{2}$ för målbakterierna. För kontami­nantstammar skall bakterietalet i fall av kraftig inhibition ligga på ca 1,5-2x$10^{3}$ på kontrollagar­plattan.
• 7. Beräkna relative Growth index* (RGI) (se definition nedan).
• 8. Bedöm och notera kolonidiameter, koloniutseende och kolonifärg samt eventuella andra karakte­ristika.

• • Relative Growth index= CFU av enskild bakterietyp på test­plattan/CFU av samma bakterietyp på icke in­hiberande kontrollplatta. Kvoten uttrycks i procent. Detta bör ligga över 50 % för målbakterier med god växt, men kan för målbakte­rier med dålig växt ligga på ett par procent. Vissa kontaminantstammar växer inte alls på testagar, detta in­nebär ett RGI<0,1 %, men andra stammar inhiberas i mindre omfattning (se tabell 26).

Det är fördelaktigt (hör ej till referensmetodiken) att också inokulera bland­kulturer av referensstam­marna bestående av en (eller ett par) typer av mål­bakterier i kombination med två eller helst tre olika kon­taminanter. Man kan därvid jämföra substratens egenskaper i en situa­tion som i någon mån simule­rar ett kliniskt prov. Avsikten är i första hand att bedöma substratens differentie­rande egenskaper, d.v.s. koloni­karakteristika skall vara framträdande och en­skilda arter identifierbara. Det skall observeras att growth index för en viss bak­terieart som be­stämts för renkultur kan ändras när samma bakterieart in­okuleras till­sammans med andra bakteriearter. Förfarandet har ej standardiserats, men reproducerbara resultat kan nås med flera kombinationer (Thore, Lindman SMI-tryck 127-1999. ej i Wikiformat).

Testförfarande vid den fortlöpande tillverkningen av fasta substrat, refe­rensmetod

För fortlöpande tillverkningskontroll av selektiva substrat (i första hand DC-Hynes, XLD, Hektoen och CIN-agarmedier) utgör Mossel´s eco­metriska me­tod referensmetod. Denna metod är enkel att ut­föra och ger uppfattning om selektiv kapacitet hos substratet. Principen är att inokulera bakterier i log­fas enligt ett visst mönster på agarytan (Figur 16) och med hjälp av växt-endpoint beräkna absolut growth index (AGI, för definition se Tabell 25) och relative growth index (RGI, för definition se nedan) efter jämförelse mot växt på kon­trollagar. Det är tillräckligt att testa en referensstam vardera av Salmonella, Shigella och Yersinia samt E. coli CCUG 17620.

Utförande:

• 1. Respektive bakteriekulturer inokuleras i 5 mL peptonbuljong.
• 2. Inkubera i 4 timmar i 35 °C - 37 °C.
• 3. Indela agarplattan som skall testas i fyra segment märkta A-D enligt fig 16.
• 4. Doppa en 1 µL plastinös i buljongen där bakterierna nu befinner sig i logfas. OBS! Endast själva öglan skall doppas, annars blir inoku­latet för stort.
• 5. Inokulera agarplattan med plastinösen i konstant vinkel (ca 45°) en­ligt fig 16. (från A1 till D5).
• 6. Inokulera ytterligare en testplatta enligt moment 3-5 samt en kontroll­platta (CLED-agar eller MacConkey-agar), för varje enskild bakterietyp.
• 7. Inkubera plattorna övernatt i 35 °C - 37 °C (CIN-agar i 28 °C - 30 °C).
• 8. Notera det segment där växt sist förekommer (endpoint) på respek­tive test- och kontrollplattor. Vid avsaknad av växt i mer än två seg­ment (d.v.s. två överhoppade segment) anses endpointen vara den sista med växt före avbrottet.
• 9. Absolut growth index (AGI) kalkyleras enligt nedanstående tabell 25 och relativ growth index (RGI) enligt formel (se under Tabell 25 nedan).

Krav för godkänd testning är växt på CLED-agar med ett AGI>75.

---

Notera det segment på respektive test- och kontrollplattor där växt sist före­kommer (endpoint). Vid avsaknad av växt i två segment eller fler (d.v.s. två eller fler överhoppade segment), sker avläsning i det närmast föregående seg­mentet med växt.

Tabell 25. Kalkylering av absolut growth index (AGI) genom ut­tryckande av ett indexvärde (5-100) från noterad växt-endpoint (A1-D5):

Kvadrant A	Kvadrant B	Kvadrant C	Kvadrant D
A1 = 5	B1 = 10	C1 = 15	D1 = 20
A2 = 25	B2 = 30	C2 = 35	D2 = 40
A3 = 45	B3 = 50	C3 = 55	D3 = 60
A4 = 65	B4 = 70	C4 = 75	D4 = 80
A5 = 85	B5 = 90	C5 = 95	D5 = 1000

Formel för beräkning av relativ growth index (RGI):

• AGI of test x 100
• AGI of control

I Tabell 26 visas kontaminantstammar som kan användas vid kon­troll av fecessubstrat. Målbakteriestammar för substratkontroller redo­visas i Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial

Tabell 26. Kontaminantstammar att använda som referensstammar vid lottest­ning och fortlöpande tillverknings­kontroll av fecessubstrat enligt referens­metodiken.

Bakterie	CCUG	ATCC	Karakteristika	Växt på XLD$^{1}$	Växt på DC-Hynes$^{1}$	Växt på CIN$^{1}$
E. coli	17 620	25 922	negativ kontroll	<0,1	<0,1	<0,1
E. coli	30 600	35 218	ej fullständig inhibition	>25	<1	<0,1
Citrobacter braakii	41 766			>50	>25	>75
Proteus mirabilis	26 767	24 906	får ej svärma	>50	>10	<0,1
P. aeruginosa	551	10 145		>25	>10	<0,1
Enterococcus hirae	1332	8043	negativ kontroll	<0,1	<0,1	<0,1

$^{1}$ Avser relative growth index (uttryckt i procent) med pipetteringsteknik, d.v.s. antal CFU testagar x100/antal CFU kontrollagar (CLED eller Mac­Conkey)

Kommentar till referensmetodiken för testning av fasta substrat

Referensmetodiken anger nivå för substratkontroll med syftet att bi­behålla en hög och jämn kvalitet på de substrat som används vid feces­diagnostiken. Lot­jämförelse vid årlig upphandling skall utföras och dokumenteras. Om flera laboratorier går samman för gemensamt upp­köp av ett substrat, är det tillräck­ligt att ett av laboratorierna utför denna lotjämförelse. Fortlöpande tillverknings­kontroll på det enskilda laboratoriet skall utföras och dokumenteras. Ett accep­tabelt alternativ till Mossells ecometriska metod är att rensprida renkulturer upp­slammade i PBS av ett antal målbakterier och kontaminanter. En metod som också är användbar för MacConkey-agar. Härvid skall differentie­rande koloni­parametrar jämföras mot pågående serier varför det är vik­tigt att fria kolonier erhålles. Observera att ingen eller ringa uppfattning därvid erhålles om substra­tets selektiva egenskaper.

Testförfarandet vid den fortlöpande tillverkningen av anrikningsbuljonger (Rappaport och Selenit)

Vid den fortlöpande tillverkningen (kan också gälla lottestning inför uppköp) av anrikningsbuljonger för Salmonella-bakterier rekommende­ras nedanstående metoder avsedda att testa och dokumentera sub­stra­tens selektiva egenskaper och förmåga att anrika Salmonella. Observera att metoderna ej standardi­serats i tillräcklig omfattning och därför inte utgör referensmetodik. Principen är att utmana substratets egenskaper med metodologi som liknar den kliniska situatio­nen. Därvid kan de in­hibitoriska egenska­perna prövas genom att tillsätta ca $10^{6}$ E. coli-bakterier (lämplig stam CCUG 30600) med krav på nära nog fullständig in­hibition, samtidigt som den anrikande förmågan prövas genom att till­sätta ca 10 S. Typhimurium (lämplig stam CCUG 31969) eller ca $10^{2}$ S. Senftenberg (CCUG 37886) med krav på anrikning. Alter­nativt kan ne­gativ feces på bo­mullspinne (ca 0,02 g) tillsättas tillsammans med re­spektive Salmonella-stam­mar.

Utförande:

• 1. Mixa omsorgsfullt i 5 mL PBS kolonier av E. coli från en agaryta (t.ex. blod) eller från en tvättad övernattkultur i buljong till McFarland 1,0 (motsvarar ca >5x$10^{7}$ bakterier/mL).
• 2. Tillsätt till önskat antal rör av testbuljongen vardera 30 µL (pipett eller 3x10 µL ögla) av E. coli-suspensionen (motsvarar drygt 106 bakterier).
• 3. Förfar på samma sätt med Salmonella-stammarna men späd dessa till McFarland 0,5 och därefter ytterligare till lämplig koncentra­tion (cirka 1,5x$10^{3}$ bakterier/mL av S. Typhimurium och 1,5x$10^{4}$ bakt/mL av S. Senftenberg).
• 4. Tillsätt 10 µL (pipett eller 10 µL ögla) av vardera Salmonella-suspension till de rör där E. coli inokulerats.
• 5. Observera att det är lämpligt att från varje suspension göra viable count i detta skede.
• 6. Inkubera rören övernatt i angiven temperatur.
• 7. Sprid med 1 µL ögla på XLD (Hektoen), MacConkey och CLED.

Förväntat resultat: Salmonella anrikas och ger därvid riklig utväxt på XLD (Hektoen); säkrast resultat med Rappaport vid 41,5 °C ± 0,5 °C inkuberings­tem­pe­ratur. Enstaka växt av E. coli kan förekomma. MacConkey- och CLED-plattor används som stödjande kontrollplattor, och förväntas ge mer uttalad växt av E. coli.

REFERENSER

• Taylor, W.I. Isolation of Shigellae. Xylose, Lysine Agars; New media for the isolation of enteric pathogens. Am J Clin Path 1965;44:471-475.

• Hynes. M. The isolation of intestinal pathogens by selective media. J Path Bact 1942;54:193-207.

• King, S. and Metzger, W.I. A new plating medium for the isolation of enteric pathogens. Hektoen enteric agar. Appl. Microbiol 198;16:577.

• Leifson, E. New Selenite enrichment media for isolation of typhoid and paraty­phoid (Salmonella) bacilli. Am J Hyg 1936;24:423-432.

• Peterz, M et al. The effect of incubation temperature and magnesium chloride concentra­tion on growth of Salmonella in home-made and in commercially available dehydrated Rappa­port-Vassiliadis broths. J Appl Bacterio­l­ogy.1989;66:523-528.

• Vassiliades P. The Rappaport Vassiliades (R.V.) enrichment medium for the isolation of Salmonella: An overview. J Appl Bacteriol 1983;56:69-76.

• Schiemann, D.A. Synthesis of a Selective agar medium for Yersinia enterocoli­tica, Can J Microbiol 1979;25:1298-1304.

• Blom et al. Evaluation of Statens Serum Institut Enteric Medium for detection of enteric pathogens. J Clin Microbiol. 1999;37:2312-2316.

• Marler et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J Clin Microbiol. 1992;30:514-516.

• George WL, Sutter VL, Citron D, Finegold SM. Selective and differential me­dium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol 1979;9:214,

• MacConkey, A.T. Lactose – fermenting bacteria in faeces J Hyg (Camb), 1905;5:333-379.

• West et al. Statistical evaluation of a quality control method for isola­tion of pathogenic Vibrio species on selected TCBS agars. J Clin Microbiol. 1982;16:1110-1116.

• The Oxoid Manual 7th edition 1995 sid 2-171

• Gästrin B, Kallings L O and Marcetic A. The survival time for different bacteria in various transport media. Acta Path Microbiol Scand 1968;74:371-380.

• Wang, W-L, et al. Evaluation of transportmedia for Campylobacter jejuni in human fecal specimens. J Clin Microbiol 1983;18:803-807.

• CEN pr EN TC 140/WG7/N22E. Culture media for microbiology-performance criteria for culture media.

• Hyde, W.A. Quality control in medical bacteriology, a practical approach. Chapter 10. eds Hawkey and Lewis, 1989.

• Miller, J.M. Quality control of Media, reagents and stains. Chapter 20. In Ma­nual of Clinical Microbiology, 4th edition, 1990.

• Mossel et al. Quality assurance of selective culture media for bacteria. J Appl Bacteriology. 1983;54:313-327.

• NCCLS Document M22-A. Vol 10. No 14. 1990. Quality assurance for com­mercially prepared microbiological culture media.

• Rautio N. Performance criteria for culture media. Examensarbete 10p. Avd klin mikrobiol, UAS, 1995.

• M Thore, R Lindman. Utvärdering av mikrobiologiska substrat för faecesdiag­nostik och metoder för kontroll av sådana substrat. SMI-tryck nr 127-1999.

• Weenk. Microbiological assessment of culture media: comparison and statistical evaluation of methods. Int J Food Microbiol 1992;17:159-81.