Skillnad mellan versioner av "PCR-påvisning av Mycoplasma genitalium-bilaga3"
| (4 mellanliggande sidversioner av 2 användare visas inte) | |||
| Rad 1: | Rad 1: | ||
''Huvudartikel: [[Mycoplasma genitalium]]'' | ''Huvudartikel: [[Mycoplasma genitalium]]'' | ||
| − | '' | + | ''Sekundärartikel till: [[Mycoplasma genitalium-laboratoriediagnostik]]'' |
---- | ---- | ||
| Rad 28: | Rad 28: | ||
UNG (Uracil-DNA Glycosylase) (Roche) | UNG (Uracil-DNA Glycosylase) (Roche) | ||
| − | LightCycler Capillaries 20 | + | LightCycler Capillaries 20 μL (Roche) |
Vid extraktion i MagnaPure: | Vid extraktion i MagnaPure: | ||
| Rad 45: | Rad 45: | ||
*Positiv 1. Extraktionskontroll: Poolade positiva urinprover spädda 1/10 med negativa urinprover. Prepareras och analyserassom patientprover. Notera aktuell ”crossingpoint” vid LC-PCR-körning. | *Positiv 1. Extraktionskontroll: Poolade positiva urinprover spädda 1/10 med negativa urinprover. Prepareras och analyserassom patientprover. Notera aktuell ”crossingpoint” vid LC-PCR-körning. | ||
| − | *Positiv 2. Renat DNA isolerat från ''Mycoplasma genitalium'' ATCC 33530D, konc 1 ng/ | + | *Positiv 2. Renat DNA isolerat från ''Mycoplasma genitalium'' ATCC 33530D, konc 1 ng/μL, spädd till 10-5. Alternativt kan kontroll erhållas från SSI eller genom Kliniskt Forskningscenter US Örebro. Det är en DNA-preparation från ''M. genitalium'' spädd 10-5 innehållande <math>10^6</math> genom/mL. Denna späs till att motsvara cirka 5 genom/5 μL. |
*Negativ: PCR-rent vatten | *Negativ: PCR-rent vatten | ||
| − | Inhibitionskontroll: 4 | + | Inhibitionskontroll: 4 μL av provtemplat och 1 μL av positiv kontroll sätts till separat kapillär med mastermix. |
| Rad 57: | Rad 57: | ||
Centrifugera 20 000 g i 10 minuter. | Centrifugera 20 000 g i 10 minuter. | ||
| − | Vid extraktion i extraktionsrobot: Sug av supernatanten av men lämna ca 300 | + | Vid extraktion i extraktionsrobot: Sug av supernatanten av men lämna ca 300 μL av urinen kvar i röret. Slamma upp pelleten i kvarvarande urin och hantera sedan enligt anvisning. |
Vid manuell preparering: Sug av hela supernatanten och slamma pelleten i Chelex 100-lösning enligt nedan | Vid manuell preparering: Sug av hela supernatanten och slamma pelleten i Chelex 100-lösning enligt nedan | ||
*Cervix/vagina/uretra prov i 2 SP: | *Cervix/vagina/uretra prov i 2 SP: | ||
Vid extraktion med robot: extrahera provet efter att det skakats på vortex utan centrifugering enligt anvisning. | Vid extraktion med robot: extrahera provet efter att det skakats på vortex utan centrifugering enligt anvisning. | ||
| − | Vid manuell preparering: Skaka provet på vortex och överför därefter 100 | + | Vid manuell preparering: Skaka provet på vortex och överför därefter 100 μL till 1,0 mL 0,85 % NaCl i kryorör och centrifugera som urinprov. Sug av supernatanten och resuspendera pelleten i 300 μL Chelex 100-lösning och skaka på vortex 60 sekunder. Inkubera i värmeblock 95-99 0C i 10 minuter. Centrifugera 5 min i 11 000 rpm. |
[[Fil:Mgentilmastermix.jpg|center]] | [[Fil:Mgentilmastermix.jpg|center]] | ||
*Provsättning: | *Provsättning: | ||
| − | Sätt kapillärer i kylblock och pipettera 15 | + | Sätt kapillärer i kylblock och pipettera 15 μL mastermix och 5 μL extraherat prov enligt protokoll |
[[Fil:Mgenitpcr.jpg| center]] | [[Fil:Mgenitpcr.jpg| center]] | ||
| Rad 76: | Rad 76: | ||
== REFERENSER == | == REFERENSER == | ||
| − | 1. Jensen JS, Björnelius E, Dohn B et al. Use of Taqman 5´ nuclease real-time PCR for quantitative detection of ''Mycoplasma genitalium'' DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol 2004;42:683-692 | + | *1. Jensen JS, Björnelius E, Dohn B et al. Use of Taqman 5´ nuclease real-time PCR for quantitative detection of ''Mycoplasma genitalium'' DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol 2004;42:683-692 |
| − | 2. Edberg A, Jurstrand M, Johansson E, et al. A comparative study of three different PCR assays for detection of ''Mycoplasma genitalium'' in urogenital specimens from men and women. J Med Microbiol 2008 Mar; 57(Pt 3):304-9. | + | *2. Edberg A, Jurstrand M, Johansson E, et al. A comparative study of three different PCR assays for detection of ''Mycoplasma genitalium'' in urogenital specimens from men and women. J Med Microbiol 2008 Mar; 57(Pt 3):304-9. |
| + | [[Kategori:Laboratoriediagnostik-STI]] | ||
Nuvarande version från 24 januari 2010 kl. 11.43
Huvudartikel: Mycoplasma genitalium
Sekundärartikel till: Mycoplasma genitalium-laboratoriediagnostik
Nukleinsyrapåvisning av Mycoplasma genitalium (ej referensmetod)[redigera]
Analysprincip[redigera]
Metoden beskriver analysförfarandet vid nukleinsyrapåvisning med realtids-PCR utförd i LightCycler 1.5 (samma prestanda uppnås i LightCycler 480) (Roche Molecular Biochemicals) och detektion med TaqMan MGB (minor grove binder) probe. Mål-DNA är sekvens på 78 bp inom konserverad del av adhesionsgenen MgPa.
Reagenser[redigera]
- Probe TaqMan MgPa-380 probe (FAM-ACT TTG CAA TCA GAA GGT-MGB) (Applied Biosystems)
- Primer MgPa-355Forward (5´-GAG AAA TAC CTT GAT GGT CAG CAA-3´)
- Primer MgPa-432Reverse (5´-GTT AAT ATC ATA TAA AGC TCT ACC GTT GTT ATC-3´)
LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes eller LightCycler TaqMan Master eller (Roche)
UNG (Uracil-DNA Glycosylase) (Roche)
LightCycler Capillaries 20 μL (Roche)
Vid extraktion i MagnaPure: DNA Isolation Kit (Roche)
Vid manuell extraktion: Chelex 100 (Bio-Rad Lab. AB), spädd till 5 % (w/v) i destillerat vatten
Analysprocedur[redigera]
Intern kontroll[redigera]
- Positiv 1. Extraktionskontroll: Poolade positiva urinprover spädda 1/10 med negativa urinprover. Prepareras och analyserassom patientprover. Notera aktuell ”crossingpoint” vid LC-PCR-körning.
- Positiv 2. Renat DNA isolerat från Mycoplasma genitalium ATCC 33530D, konc 1 ng/μL, spädd till 10-5. Alternativt kan kontroll erhållas från SSI eller genom Kliniskt Forskningscenter US Örebro. Det är en DNA-preparation från M. genitalium spädd 10-5 innehållande genom/mL. Denna späs till att motsvara cirka 5 genom/5 μL.
- Negativ: PCR-rent vatten
Inhibitionskontroll: 4 μL av provtemplat och 1 μL av positiv kontroll sätts till separat kapillär med mastermix.
Provberedning[redigera]
- Prov utgörs av 5-10 mL förstaportions urin, för kvinnor kompletterad med prov från cervix/vagina. Pinnprov från cervix/vagina sätts i samma rör som urinprovet. Förvara prov i kyl men frys ej. Kan förvaras i kyl i minst 7 dygn.
- Urinprov och cervix/vagina i urin: Skaka prov på vortex och överför därefter 2 mL urin till ett kryorör.
Centrifugera 20 000 g i 10 minuter.
Vid extraktion i extraktionsrobot: Sug av supernatanten av men lämna ca 300 μL av urinen kvar i röret. Slamma upp pelleten i kvarvarande urin och hantera sedan enligt anvisning. Vid manuell preparering: Sug av hela supernatanten och slamma pelleten i Chelex 100-lösning enligt nedan
- Cervix/vagina/uretra prov i 2 SP:
Vid extraktion med robot: extrahera provet efter att det skakats på vortex utan centrifugering enligt anvisning. Vid manuell preparering: Skaka provet på vortex och överför därefter 100 μL till 1,0 mL 0,85 % NaCl i kryorör och centrifugera som urinprov. Sug av supernatanten och resuspendera pelleten i 300 μL Chelex 100-lösning och skaka på vortex 60 sekunder. Inkubera i värmeblock 95-99 0C i 10 minuter. Centrifugera 5 min i 11 000 rpm.
- Provsättning:
Sätt kapillärer i kylblock och pipettera 15 μL mastermix och 5 μL extraherat prov enligt protokoll
Jämförelser Denna realtids-PCR har jämförts genom provutbyte om 55 kliniska prover mellan laboratorierna i Västerås och Falun med jämförbart resultat (22 positiva i Västerås mot 21 positiva i Falun). Metoden används på flera laboratorier i landet och är ursprungligen utvecklad på Örebrolaboratoriet och jämförd mot konventionell PCR på Statens Seruminstitut (SSI) i Köpenhamn.
REFERENSER[redigera]
- 1. Jensen JS, Björnelius E, Dohn B et al. Use of Taqman 5´ nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol 2004;42:683-692
- 2. Edberg A, Jurstrand M, Johansson E, et al. A comparative study of three different PCR assays for detection of Mycoplasma genitalium in urogenital specimens from men and women. J Med Microbiol 2008 Mar; 57(Pt 3):304-9.