Skillnad mellan versioner av "Bilaga 6. Parasitologiska metoder"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(5 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte)
Rad 7: Rad 7:
 
=== Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces ===
 
=== Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces ===
 
Se länk [[PAR 01 Cystor och maskägg, feces koncentration|PAR 01 ]]
 
Se länk [[PAR 01 Cystor och maskägg, feces koncentration|PAR 01 ]]
−
 
−
=== Kvalitetssäkring ===
 
−
 
−
'''Intern'''
 
−
Koncentrationsförfarandet kontrolleras årligen genom att antalet cystor/maskägg i prov med känt innehåll räknas före och efter koncentrering. För lämpligt bild¬material se referens 4 och 5.
 
−
 
−
 
−
 
−
'''Extern'''
 
−
 
−
UK-NEQAS fecesutskick.
 
−
 
−
 
−
==== Anmärkningar ====
 
−
 
−
* Tillsatts av Triton X till feces uppges ge ökat utbyte av maskägg.
 
−
* Metallsil med maskstorlek 425 µm kan användas som alternativ till fuktad gasväv för att filtrera prov.
 
−
 
−
 
−
=== Referenser ===
 
−
 
−
*1. Allen A V H, Ridley D D. Further observations on the formolether concentration technique for faecal 0parasites. J Clin Path 1970;23:545-546.
 
−
*2. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
 
−
*3. NEQAS informationsblad: Formolether concentration method for ova and cysts
 
−
*4. Young K H, Bullock S L, Melvin D M, Sprull C L. Ethyl acetate as a substitute for diethyl ether in the Formalin-ether sedimentation technique. J Clin Microbiol 1979;10:852-853.
 
−
*5. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 1-9
 
−
 
−
 
  
 
== Bilaga 6 B.==
 
== Bilaga 6 B.==
−
 
  
 
=== Mikroskopisk påvisning av ''Cryptosporidium'', ''Cyclospora'' och ''Isosporao''ocystor efter färgning med modifierad Ziehl-Neelsen ===
 
=== Mikroskopisk påvisning av ''Cryptosporidium'', ''Cyclospora'' och ''Isosporao''ocystor efter färgning med modifierad Ziehl-Neelsen ===
−
 
+
Se länk [[PAR 02 Ziehl-Neelsen färgning|PAR 02 ]]
−
 
 
−
 
 
−
=== Analysprincip ===
 
−
 
 
−
Mikroskopisk påvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut på objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol och bakgrundsfärgas med malakitgrönt. Oocystorna färgas röda mot en grön bakgrund.
 
−
 
 
−
*Apparatur
 
−
**dragskåp
 
−
**automatpipett 10 - 50 µL
 
−
**ljusmikroskop med objektiv 40x,
 
−
**mmersionsobjektiv (50x) 100x
 
−
**kalibrerat mätokular
 
−
 
 
−
*Material
 
−
**objektglas med mattfält
 
−
**pipettspetsar 10 - 50 µL
 
−
**glaskyvett/färgställ
 
−
**pasteurpipetter plast
 
−
**avfallsburk
 
−
**täckglas *Reagens
 
−
** Metanol 99,8 % CH3OH p.a. Merck 1.06009
 
−
** Karbolfuchsinlösning
 
−
 
 
−
*
 
−
**Färdigberedd Karbolfuchsinlösning Tb color
 
−
Merck 1.08512.0500
 
−
 
 
−
 
 
−
 
 
−
'''Alternativ II'''
 
−
*Karbolfuchsinlösning (Referens 1)
 
−
* Basiskt fuchsin 10 g
 
−
*Etanol 99,5 % 100 ml
 
−
* Fenol 50 g
 
−
* Destillerat vatten 1000 mL
 
−
 
 
−
Lös 10 g basiskt fuchsin i 100 mL etanol. Använd en flaska som rymmer minst 1 500 mL. Väg upp 50 g fenol i en bägare och lös det i en del av vattnet. Blanda alltsammans i flaskan. Sätt till resten av vattnet och blanda ånyo. Märk flaskan enligt ovanstående rubrik.
 
−
 
 
−
* Saltsyra i etanol
 
−
Avfärgningslösning för Ziehl-Neelsen
 
−
 
 
−
*Blanda 10 mL konc HCl med 1990 mL 95 % etanol.
 
−
* Malakitgrönt 1 %
 
−
*Lös 1 g malakitgrönt i 100 mL destillerat vatten.
 
−
*• DPX mounting medium
 
−
*• Positiv kontroll Ziehl-Neelsen färgning
 
−
*Formalinfixerat fecesprov med Cryptosporidium-oocystor
 
−
*• Immersionsolja för ljusmikroskop
 
−
 
 
−
*Analysprocedur
 
−
'''Förbehandling av provmaterial'''
 
−
 
 
−
För att höja känsligheten rekommenderas att färgningen utförs på både koncentrerat och okoncentrerat feces. Fecesprover som innehåller rikligt med slem kan nämligen förlora parasiter vid koncentrering. För koncentrering av feces se metodbeskrivning Bilaga 6.1.
 
−
 
 
−
 
 
−
*Färgningsprocedur
 
−
 
 
−
**1. Märk objektglasets mattfält med labnummer. Positiv kontroll skall ingå i varje färgningsomgång.
 
−
**2. Stryk med pipettspetsen ut ca 20 µL av provmaterialet på objektglaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter.
 
−
**3. Låt preparatet lufttorka i minst 60 min.
 
−
**4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock.
 
−
**5. Lägg glaset på färgstället och täck med karbolfuchsin. Använd plastpasteurpipett. Färga 20 min.
 
−
**6. Skölj med rikligt rinnande kranvatten.
 
−
**7. Avfärga ett glas i taget med avfärgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda färgen är borta.
 
−
**8. Skölj med rikligt rinnande kranvatten.
 
−
**9. Täck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min.
 
−
**10. Skölj med rikligt rinnande kranvatten.
 
−
**11. Låt preparatet torka.
 
−
**12. Montera med DPX och täckglas.
 
−
**13. Låt preparatet torka.
 
−
 
 
−
 
 
−
==== Avläsning ====
 
−
 
 
−
Granska hela preparatet. Använd 40x eller 50x objektiv för översiktsgranskning och 100x immersionsobjektiv för verifiering. Mät storleken på eventuella oocystor med mätokular. För morfologiska kriterier av olika oocystor se under respektive parasitavsnitt.
 
−
 
 
−
'''Kvalitetssäkring'''
 
−
*Internkontroll
 
−
**Positiv kontroll: Fecesprov med känt innehåll av formaldehydfixerade ''Cryptosporidium''-oocystor. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prover.
 
−
 
 
−
**För bildmaterial se referens 4.
 
−
 
 
−
=== Externkontroll ===
 
−
UK-NEQAS fecesutskick
 
−
 
 
−
=== Säkerhetsaspekter ===
 
−
Iakttag försiktighet vid arbete med ej avdödat provmaterial. 3,7 % formaldehyd under 30 min avdödar ''Cryptosporidium''-oocystor.
 
−
 
 
−
 
 
−
=== Referenser ===
 
−
 
 
−
*1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987;216-218.
 
−
*2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995;96-97.
 
−
*3. NEQAS Teaching sheet nr 932. ''Cryptosporidium'', ''Isospora belli'' and Cyclospora.
 
−
*4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora.
 
  
 
== Bilaga 6 C. ==
 
== Bilaga 6 C. ==
Rad 141: Rad 17:
  
 
=== Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikrom-färgning ===
 
=== Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikrom-färgning ===
−
+
Se länk [[PAR 03 Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikromfärgning|PAR 03 ]]
−
 
−
 
 
−
=== Analysprincip/provmaterial ===
 
−
 
 
−
'''Cytokemisk färgningsmetod speciellt lämpad för påvisning av trofozoiter.''' Även cystor kan påvisas med denna metod. Feces eller annat provmaterial fixeras i SAF (sodium acetate-acetic acid formalin) fixativ i omedelbar anslutning till provtagningen. Parasiterna infärgas i olika röda och blågröna nyanser mot en grön bakgrund. Avläsning sker i ljusmikroskop.
 
−
 
 
−
*Apparatur
 
−
**centrifug
 
−
**dragskåp
 
−
**ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
 
−
**samt immersionsobjektiv 50x och 100x
 
−
 
 
−
*Material
 
−
**träpinnar
 
−
**gasväv
 
−
**engångsplastmuggar
 
−
**centrifugrör med skruvlock, 10 mL plast
 
−
**plastpasteurpipett
 
−
**objektglas med mattfält
 
−
**glaskyvetter med lock
 
−
**täckglas
 
−
**avfallsburk
 
−
 
 
−
*Reagens
 
−
** SAF-fixativ. Sodium acetate-acetic acid formalin (Meridian Diagnostics, art nr 900212: färdiga provtagningsrör). Kan även köpas separat, art nr 11-9007.
 
−
 
 
−
Ovanstående fixativ består av följande ingredienser:
 
−
 
 
−
** Ättikssyra (isättika) 100 % 2 %
 
−
** Formaldehyd 1,6 %
 
−
** Natriumacetat 0,9 %
 
−
** Metanol 0,4 %
 
−
** Ytspänningsnedsättande ämne 0,1 %
 
−
** Avjoniserat vatten
 
−
 
 
−
**• Natriumklorid 0,9 %
 
−
** Albuminlösning, Mayer´s albumin, Meridian (medföljer SAF-fixativrör Meridian , art nr 900212)
 
−
** Etanol 70 %
 
−
*• Trikromfärg
 
−
 
 
−
Trichrome stain (Meridian Diagnostics art nr 400101)
 
−
 
 
−
'''Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:'''Chromotrope 2R 6 g
 
−
*Light green SR 1,5 g
 
−
*Fast green FC 1,5 g
 
−
*Fosforwolfram syra 7 g
 
−
*Isättika 10,5 g
 
−
*Destillerat vatten 1000 mL
 
−
 
 
−
*Ättiksyra i etanol 90 %
 
−
 
 
−
'''Avfärgningslösning för trikromfärgning'''
 
−
 
 
−
*Ättikssyra (isättika) 100 % 4,5 mL
 
−
*Etanol 90 % 995,5 mL
 
−
 
 
−
 
 
−
* Etanol 95 %
 
−
* Etanol 99,5 %
 
−
* Histoclear
 
−
 
 
−
Apelsinolja, d-limonen, C10H16, 70-100 % National Diagnostics HS-200
 
−
* DPX mounting medium
 
−
* Immersionsolja för ljusmikroskopi
 
−
 
 
−
 
 
−
==== Analysprocedur ====
 
−
 
 
−
'''Observera att varje färgningsomgång skall innehålla en positiv kontroll.''' Se under kvalitetssäkring.
 
−
 
 
−
*1. Nytagen feces (utan tillsats) fixeras omedelbart i SAF-fixativ. Fyll med feces till markeringen på provtagningsröret. Blanda feces och vätska ordentligt med träpinnar. Låt stå minst 30 min. Prov som insänts i SAF-fixativ blandas ånyo; rör om med träpinnar.
 
−
*2. Filtrera en del av blandningen genom ett lager fuktad gasväv lagt över en engångsplastmugg.
 
−
*3. Häll över ca 3 mL av den filtrerade blandningen i ett centrifugrör. Fyll röret med 0,9 % NaCl.
 
−
*4. Centrifugera 1 min i 800 x g .
 
−
*5. Häll av ovanvätskan så att ca 1 mL finns kvar i röret. Späd med 0,9 % NaCl om provet verkar för tjockt.
 
−
*6. Droppa en droppe albuminlösning och en droppe av provet på ett objektglas märkt med labnr. Blanda om med en träpinne och gör ett tunt utstryk som varierar i tjocklek.
 
−
*7. Låt preparatet torka tills det ser "klibbigt" ut (ca 10 - 20 min).
 
−
 
 
−
 
 
−
'''Fixering och färgningsprocedur'''. Låt överskottsvätska rinna av mot en allduk mellan varje kyvett.
 
−
 
 
−
*1. Fixera glaset 30 min i 70 % etanol.
 
−
*2. Låt stå i trikromfärg 6 - 8 min. Torka försiktigt av överskottsfärg mot en allduk.
 
−
*3. Doppa glaset i avfärgningslösning (ättiksyra i etanol).Observera glaset noggrant. Stoppa ner det i nästa bad precis när färgen bör¬jar rinna från utstryket. Två snabba dopp brukar vara tillräckligt.
 
−
*4. Skölj 2 gånger i 95 % etanol.
 
−
*5. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
 
−
*6. Låt stå i 99,5 % etanol 3 min.
 
−
*7. Låt stå i Histoclear 3 min.
 
−
*8. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka i dragskåp.
 
−
 
 
−
 
 
−
==== Avläsning av preparat ====
 
−
 
 
−
Granska 100 synfält med immersionsobjektiv 50x. För identifiering av trofozoiter och cystor används immersionsobjektiv 100x. Använd mätokular när så behövs. För morfolologiska kriterier av de olika parasiterna se under respektive avsnitt.
 
−
 
 
−
 
 
−
=== Kvalitetssäkring ===
 
−
 
 
−
Positiv kontroll: Fecesprov innehållande tvättade SAF-fixerade ''Dientamoeba fragilis''-trofozoiter (eller annan lämplig parasit). Förvaras i kylskåp.
 
−
 
 
−
Lämpligt bildmaterial finns under ref 2 och 3.
 
−
 
 
−
 
 
−
=== Anmärkningar ===
 
−
 
 
−
Metoden lämpar sig särskilt väl för diagnostik av ''Dientamoeba fragilis'' då denna parasit saknar cystform.
 
−
 
 
−
 
 
−
=== Referenser ===
 
−
*1. Meridian produktinformation för Para-Pak SAF-rör och Para-Pak Trichrome stain.
 
−
*2. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 5-9 Protozoa.
 
−
*3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
 
−
 
  
 
== Bilaga 6 D. ==
 
== Bilaga 6 D. ==
Rad 261: Rad 24:
 
=== Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer efter förstärkt trikromfärgning ===
 
=== Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer efter förstärkt trikromfärgning ===
  
 +
Se länk [[PAR 04 Mikrosporidier|PAR 04]]
  
  
−
==== Analysprincip ====
 
−
 
−
Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer. Lufttorkade preparat fixeras med metanol, infärgas med modifierad trikromfärg, avfärgas och dehydreras. Avläsning sker i ljusmikroskop. Sporerna färgas rosa mot en blå bakgrund.
 
−
 
−
*Apparatur
 
−
**centrifug
 
−
**dragskåp
 
−
**automatpipett 10 - 50 µL
 
−
**ljusmikroskop med kalibrerat mätokular
 
−
**immersionsobjektiv 100x
 
−
 
−
*Material
 
−
**objektglas med mattfält
 
−
**pipettspetsar 10 - 50 µL
 
−
**glaskyvetter med lock
 
−
**täckglas No 0.
 
−
 
−
*Reagenser
 
−
** Formaldehydlösning 3,7 % (=10 % formalin. En del koncentrerad formaldehyd (37 - 40 %) späds med 9 delar destillerat vatten.
 
−
** Metanol 99 %
 
−
** Förstärkt trikromfärg (Trichrome Blue, Meridian 400501)
 
−
 
−
Ovanstående färgreagens består av följande ingredienser:
 
−
 
−
*Chromotrope 2R 60,0 g
 
−
*Aniline Blue 5,0 g
 
−
**Fosforwolframsyra 2,5 g
 
−
**Isättika 30 mL
 
−
**Destillerat vatten 1000 mL
 
−
 
−
 
−
**Ättiksyra i etanol 90 %
 
−
**Ättiksyra (isättika) 100 % 4,5 mL
 
−
**Etanol 90 % 995,5 mL
 
−
**Etanol 95%,
 
−
**Etanol 99, 5 %
 
−
** Histoclear
 
−
 
−
Apelsinolja, d-limonen, C10H16 70-100 % National Diagnostics HS-200
 
−
* DPX mounting medium BDH 36029 4H
 
−
* Immersionsolja
 
−
 
−
 
−
==== Analysprocedur ====
 
−
 
−
'''Förbehandling av provmaterial'''
 
−
 
−
'''Feces:''' okoncentrerad feces fixeras i formaldehyd eller SAF.
 
−
 
−
'''Lämplig spädning:''' 1 del feces till 3 delar fixativ. Mycket tunn fecesblandning centrifugeras och sedimentet används för utstryk. För att höja känsligheten färgas även ett koncentrerat fecesprov – späd sedimentet till lämplig tjocklek.
 
−
 
−
 
−
*Färgningsprocedur
 
−
**1. Märk önskat antal objektglas. Glöm ej att ta med positiv kontroll.
 
−
**2. Stryk med pipettspetsen ut ca 10 µL av provmaterialet. Gör mycket tunna utstryk.
 
−
**3. Låt preparatet lufttorka.
 
−
**4. Fixera glaset 5 min i metanol.
 
−
**5. Placera glaset i trikromfärg. Låt stå 90 min i rumstemperatur.
 
−
**6. Torka av färgöverskottet på glasets baksida mot en allduk. Tryck försiktigt glasets framsida mot allduken.
 
−
**7. Avfärga i avfärgningslösning (ättikssyra i 90 % etanol) ungefär 5 sek. Låt överskott av vätska rinna av mot allduk mellan varje kyvett.
 
−
**8. Skölj hastigt i 95 % etanol.
 
−
**9. Låt stå i 95 % etanol 5 min.
 
−
**10. Låt stå i 99,5 % etanol 10 min.
 
−
**11. Låt stå i Histoclear 10 min.
 
−
**12. Montera det våta glaset med DPX och täckglas. Låt torka. Förvara glasen skyddade mot ljus.
 
−
 
−
 
−
 
−
==== Granskning av preparat ====
 
−
 
−
Granska 200 synfält med 100x immersionsobjektiv. För morfologiska kriterier hänvisas till avsnittet om microsporidia i denna bok.
 
−
 
−
 
−
=== Kvalitetssäkring ===
 
−
 
−
Positiv kontroll som innehåller formaldehydfixerade microsporidiasporer. Förvaras i kylskåp och behandlas som övriga prov. Lämpligt bildmaterial finns under referens 3 och 4.
 
  
  
−
=== Referenser ===
 
  
−
*1. Ryan NJ, Sutherland G, Coughlan K, Globan M, Doultree, Marshall J, Baird, Pedersen J, Dwyer B. A new trichromeblue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens. 1993;31:3264-3269.
 
−
*2. Meridian Diagnostics, Inc. Para-PacTrichrome Blue. Produktinformation.
 
−
*3. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago, fourth edition, 1997.
 
−
*4. Rondamelli EG, Scaglia M. Atlas of human protozoa. Masson 1993.
 
  
 
[[Kategori:Infektioner i mage och tarm]]
 
[[Kategori:Infektioner i mage och tarm]]
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]]
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-parasiter]]

Nuvarande version från 19 april 2012 kl. 16.05

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

Bilaga 6 A.[redigera]

Mikroskopisk påvisning av cystor och maskägg efter formalin/etylacetat koncentration av feces[redigera]

Se länk PAR 01

Bilaga 6 B.[redigera]

Mikroskopisk påvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isosporaoocystor efter färgning med modifierad Ziehl-Neelsen[redigera]

Se länk PAR 02

Bilaga 6 C.[redigera]

Mikroskopisk påvisning av trofozoiter efter trikrom-färgning[redigera]

Se länk PAR 03

Bilaga 6 D.[redigera]

Mikroskopisk påvisning av microsporidiasporer efter förstärkt trikromfärgning[redigera]

Se länk PAR 04

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Bilaga_6._Parasitologiska_metoder&oldid=10094"