CNS-infektioner-metoder för evaluering av specifikt immunsvar

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet

---

Metoder för evaluering av specifikt immunsvar i CNS

Bakgrund

Relativt lite är känt om immunologiskt aktiva celler i hjärnan. Möjligen kan mikroglia ha makrofagfunktion, och astrocyter liksom endoteliala celler kan spela roll vid antigenpresentation. Blodceller kan passera över till hjärnan, och inflammatoriska celler som hittas vid sjukliga processer kommer från blodet. Hos friska personer hittas endast lymfocyter och monocyter i CNS, medan fynd av polymorfkämiga leukocyter alltid är patologiskt.

De mjuka hinnorna i CNS har en barriärfunktion (blood-brain-barrier, BBB) som gör att en mycket liten del serumproteiner passerar till likvorrummet. Möjligheten till passage minskar ju större och ju mera negativt laddat ett protein är. IgG och IgA passerar av båda dessa skäl lättare över till likvor än IgM. Normalrelationen mellan proteinkoncentration i serum och likvor kan variera kraftigt, och vid olika studier har olika normalgränser angivits. Likvorkoncentrationen av IgG och IgA är grovt sett 0,2-0,4% av serumkoncentrationen, och för IgM är den ännu lägre.

Vid infektion i CNS ökar i de flesta fall proteinläckaget över BBB. Olika typer av leukocyter vandrar in från blodet, och eliminerar med sina olika effektormekanismer infektiöst agens eller infekterade celler. Invandringen av leukocyter speglas av cellfynden i likvor. B-celler är den celltyp som uppträder i CNS senast i sjukdomsförloppet. Specificiteten och aktiviteten av immunologiskt primade T- och B-celler kan mätas in vitro genom lymfocytstimulering, analys av cytokinaktivitet, mätning av specifik antikroppsproduktion från stimulerade B-celler och tester för specifik cytotoxisk aktivitet. Dessa tester används ännu bara i forskningssyfte. Mätning av vissa cytokiner i likvor såsom alfa-interferon anges kunna vara av diagnostiskt värde, och kan komma att inkluderas vid rutinundersökningar av likvorprov vid de kemiska laboratorierna i framtiden.

Om B-celler från blodet stimuleras till intratekal antikroppsproduktion genom antigenpresentation inom CNS kan man i likvor få en i relation till serumkoncentrationen större mängd specifika antikroppar mot presenterat agens. Förekomst av intratekal antikroppsproduktion är ett tecken på immunsvar inom CNS mot ett agens, och anses vara en säker markör för att detta orsakat sjukdom. Ett undantag är MS-patienter, som ofta har intratekal antikroppsproduktion mot ett antal virus utan att man därför har påvisat något etiologisk samband mellan dessa virus och MS. Om MS uteslutits, vilket i de flesta fall är relativt lätt, brukar påvisande av intratekal antikroppsproduktion mot ett agens anses vara diagnostiskt för pågående/genomgången infektion. Antikropparna kan mätas mycket länge ( 18 år har beskrivits för herpes simplex), varför aktualiteten av infektionen inte kan avgöras av ett intratekalt IgG-svar.

Specifika intratekal antikroppar hittas ofta inte förrän 5 dagar efter insjuknandet. Detta innebär att påvisande av intratekal antikroppsproduktion har ett begränsat värde i akutskedet av en CNS-sjukdom. Mätning är däremot mycket värdefullt när man vill verifiera osäkra akutfynd eller inte lyckats uppnå diagnos i akutprov.

Att faställa att antikroppar verkligen producerats inom CNS och inte är passivt överförda från blod kan vara mycket svårt. En rad metoder har föreslagits för att säkerställa detta. Kortfattade beskrivningar av de mest väletablerade metoderna följer nedan.

Metoder för fastställande av specifik, intratekal antikroppsproduktion

• 1. Gelseparation med immunfixation eller immunoblotting:

Både serum och likvor måste undersökas samtidigt. Mängden av den isotyp av antikropp som skall mätas justeras, så att lika stor mängd IgG från serum respektive likvor analyseras. Serum och likvor IgG separeras i band med elektrofores, eller isoelektrisk fokusering. Vid immunfixation inkuberas gelen med antigen. Antikroppar som inte bildat komplex med antigen sköljs bort. Vid immunoblotting fångas separerade specifika antikroppar på membraner eller geler, som mättats med relevant antigen. För att hitta de specifika banden används anti-antikroppar märkta med exempelvis radioaktivitet eller peroxidas. Efter framkallning jämförs mönstret i likvor och serum. Band av specifika antikroppar som finns i likvor, men inte i serum, anses vara ett säkert tecken på specifik intratekal produktion av en antikropp. Intensiteten av ett band kan också avläsas med exempelvis densitometri, och jämförelsevis starkare band i serum än i likvor kan indikera intratekal antikroppsproduktion.

• 2. Indexmetoder

Gelseparationsmetoderna anses ofta vara de mest känsliga och specifika testerna för påvisande av intratekala antikroppar, men är ofta tidsödande och materialkrävande. Vid de mikrobiologiska laboratorierna används i stället känsliga metoder, såsom ELISA, för mätning av specifika antikroppar av olika isotyp. Mängden antikroppar i serum eller likvor uttrycks med titer, absorbansvärde x spädningsfaktor eller arbiträra enheter i förhållande till en standard. Ett ratio, index, mellan likvormängd och serummängd av specifika antikroppar beräknas. Detta divideras i sin tur med likvor/serum index för totalmängd IgG eller albumin, för att korrigera för läckage över blod-hjärnbarriären. Man kan också undersöka spädningar av serum och likvor innehållande samma IgG-, IgA- eller IgM-mängd. För alla olika tekniska lösningar finns gränsvärden för patologiska antikroppsindex uträknade (tabell 10).

De ovan nämnda indexmetoderna kräver att laboratoriet känner till total- mängden av den Ig-isotyp som ska analyseras, eller av albumin. Med capture-teknik, där brunnarna coatas i en ELISA-platta med anti-isotyp, kan man fånga upp lika stor mängd antikropp från såväl serum som likvor. Enzymmärkt antigen tillsätts därefter. Om substratreaktionen ger högre absorbans i likvor än i serum föreligger intratekal antikroppsproduktion. I en annan metod undersöks parallellt antikroppar i serum och likvor mot flera antigen som coatats på en ELISA-platta. Det är lämpligt att inkludera exempelvis mässling och varicella, mot vilka de flesta människor har antikroppar. Man jämför sedan absorbans eller titerindex mellan serum och likvor för de olika antigenerna. Om ett ratio är signifikant lägre än de andra föreligger intratekal antikroppsproduktion. Det är viktigt att samma spädningar av serum och likvor undersöks i samma test, då systemet är mycket känsligt för inter-assay variation.

Totalmängd av IgG, andra isotyper eller albumin mäts sällan i samband med akuta CNS-infektioner. De sistnämnda undersökningsmetoderna lämpar sig därför bäst vid de mikrobiologiska laboratoriema. Enzymmärkta antigener kan vara svåra att producera och lagerhålla, medan den indirekta metoden tillåter användande av mera lättillgängliga, omärkta antigen.

---

REFERENSER

• Boucquey D, Chalon M-P, Sindic CJM, Lamy ME, Laterre C. Herpes simplex virus type 2 meningitis without genital lesions: an immunoblot study. J Neurol 1990;237:285-289.

• Hansen K, Cruz M, Link H. Oligocional Borrelia burgdorferi-specific IgG antibodies in cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis. J Infect Dis 1990; 161:1194-1202.

• Kaiser R, Liicking C-H. Intrathecal synthesis of specific antibodies in neuroborreliosis. Comparison of different ELISA techniques and calculation methods. J Neurol Sci 1993;118:64-72.

• Klapper PE, Laing L, Jongson M. Rapid non-invasive diagnosis of herpes encephalitis. Lancet ii 1981;607-609.

• Luxton RW, McL.ean BN, Thompson EJ. Isoelectric focusing versus quantitative measurements in the detection of intrathecal local synthesis of IgG. Clin-Chim-Acta 1990;187:297-308.

• Mathiesen T, Fridell E, Fredrikson S, Linde A, Sundqvist V-A, Edler D, Wahren B. Combination ELISA for antiviral antibodies in CSF and serum in patients with neurological symptoms and in healthy controls. J Virol Meth 1988;19:169-180.

• Pohi-Koppe A, Dahm C, Elgas M, Kuhn JE, Braun RW, ter Meulen V. The diagnostic significance of the polymerase chain reaction and isoelectric focusing in herpes simplex virus encephalitis. J Med Virol 1992;36:147-154.

• Rehse-Küpper B, Ackermann R. Demonstration of intrathecally synthesized Borrelia antibodies in cerebrospinal fluid. Z Bakt Hyg 1986;A263:407-411.

• Reiber H, Lange P. Quantitation of virus-specific antibodies in cerebrospinal fluid and serum: sensitive and specific detection of antibody synthesis in brain. Clin Chem 1991;37:1153-1160.

• Sharief-MK, Keir G, Thompson EJ. Intrathecal synthesis of IgM in neurological diseases: a comparison between detection of oligocional bands and quantitative estimation. J Neurol Sci 1990;9:131-142.

• Sindic CJM, Monteyne Ph, Laterre EC. The intrathecal synthesis of virus-specific oligocional IgG antibodies in multiple scierosis. J Neuroimmunol 1994;54:75-80.

• Souverijn JH, Serree HM, Peet R, Grenzebach-Smit W, Bruyn GW. Intrathecal immunoglobulin synthesis. Comparison of various formulae with the ‘gold standard’ of isoelectric focusing. J Neurol Sci 1991;102:11-16.