Skillnad mellan versioner av "Bilaga 5. Clostridium difficile-cytotoxin;analysprocedur"
(2 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte) | |||
Rad 10: | Rad 10: | ||
− | *Dag 1 | + | *'''Dag 1''' |
**Cirka 0,5 mL feces blandas väl med ca 2,5 mL fosfatbuffrad NaCl (PBS). | **Cirka 0,5 mL feces blandas väl med ca 2,5 mL fosfatbuffrad NaCl (PBS). | ||
**Centrifugera (minst 20 min vid 1000-1100 g, eller 5-10 min vid 13000-14000 g). | **Centrifugera (minst 20 min vid 1000-1100 g, eller 5-10 min vid 13000-14000 g). | ||
Rad 19: | Rad 19: | ||
**Tillsätt 100 µL uppehållsmedium i de tömda brunnarna. | **Tillsätt 100 µL uppehållsmedium i de tömda brunnarna. | ||
**Tillsätt 100 µL av respektive provspädning (Provspädningarna i brunnarna är nu 1/10 och 1/100). | **Tillsätt 100 µL av respektive provspädning (Provspädningarna i brunnarna är nu 1/10 och 1/100). | ||
− | **Inkubera plattan vid 37 °C i 3-10 % | + | **Inkubera plattan vid 37 °C i 3-10 % CO<SUB>2</SUB> över natt. |
Positiv kontroll utgörs av ''C. difficile''-toxin, spätt enligt tillverkarens instruktioner. Det spädda toxinet behandlas som fecessupernatant (ospätt prov). | Positiv kontroll utgörs av ''C. difficile''-toxin, spätt enligt tillverkarens instruktioner. Det spädda toxinet behandlas som fecessupernatant (ospätt prov). | ||
Rad 25: | Rad 25: | ||
Negativ kontroll. PBS används som negativ kontroll. | Negativ kontroll. PBS används som negativ kontroll. | ||
− | *Dag 2 | + | *'''Dag 2''' |
**Om provet bedöms som positivt i första eller båda spädningarna, eller är svårt eller omöjligt att bedöma, t.ex. om cellerna är upplösta eller hopklumpade görs neutralisationstest. | **Om provet bedöms som positivt i första eller båda spädningarna, eller är svårt eller omöjligt att bedöma, t.ex. om cellerna är upplösta eller hopklumpade görs neutralisationstest. | ||
− | **Neutralisationstest. Vid neutralisationstest med specifikt ''C. difficile''-antitoxin görs en titrering av fecessupernatanten för semikvantitering av toxinhalten. | + | **Neutralisationstest. Vid neutralisationstest med specifikt ''C. difficile''-antitoxin görs en titrering av fecessupernatanten för semikvantitering av toxinhalten. |
− | **Antitoxin. ''C. difficile''-antitoxin späds och förvaras enligt tillverkarens | + | **Antitoxin. ''C. difficile''-antitoxin späds och förvaras enligt tillverkarens instruktioner. |
***Späd fecessupernatanten (det ospädda provet) 1/1,25, 1/12,5, 1/125, 1/1250 och 1/12500 i PBS (t.ex. 1/1,25, 200 µL till 50 µL PBS). | ***Späd fecessupernatanten (det ospädda provet) 1/1,25, 1/12,5, 1/125, 1/1250 och 1/12500 i PBS (t.ex. 1/1,25, 200 µL till 50 µL PBS). | ||
− | ***Gör antitoxin provspädningar och PBS-provspädningar i en | + | ***Gör antitoxin provspädningar och PBS-provspädningar i en mikrotiterplatta: |
****Antitoxin provspädningar: | ****Antitoxin provspädningar: | ||
****Till vardera 3 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL ''C. difficile''-antitoxin. | ****Till vardera 3 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL ''C. difficile''-antitoxin. | ||
Rad 37: | Rad 37: | ||
***Till vardera 5 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL PBS med mikropipett. | ***Till vardera 5 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL PBS med mikropipett. | ||
***Tillsätt 50 µL av samtliga provspädningar till de 5 brunnarna. | ***Tillsätt 50 µL av samtliga provspädningar till de 5 brunnarna. | ||
− | ***Låt antitoxin provspädningarna och PBS-provspädningarna stå i | + | ***Låt antitoxin provspädningarna och PBS-provspädningarna stå i rumstemperatur 20-30 minuter. |
****Kontrollera att cellerna är bra. | ****Kontrollera att cellerna är bra. | ||
****Sug av mediet från 8 brunnar per prov i cellplattan, samt 8 brunnar för positiv kontroll och 1 brunn för den negativ kontroll. | ****Sug av mediet från 8 brunnar per prov i cellplattan, samt 8 brunnar för positiv kontroll och 1 brunn för den negativ kontroll. | ||
****Sätt 150 µL uppehållsmedium till varje brunn. | ****Sätt 150 µL uppehållsmedium till varje brunn. | ||
− | ****Sätt 50 µL av respektive PBS/provspädning (5 st) och | + | ****Sätt 50 µL av respektive PBS/provspädning (5 st) och antitoxin/provspädning (3 st) till brunnarna. De slutliga PBS/prov-spädningarna är nu 1/10, 1/100 osv., till 1/100.000 och de slutliga antitoxin/provspädningarna 1/10, 1/100 och 1/1000. |
****Positiv kontroll titreras och neutraliseras som fecessupernatant. Negativ kontroll som vid provsättning. | ****Positiv kontroll titreras och neutraliseras som fecessupernatant. Negativ kontroll som vid provsättning. | ||
− | ****Inkubera plattan i 3–10 % | + | ****Inkubera plattan i 3–10 % CO<SUB>2</SUB> över natt. |
=== Avläsning === | === Avläsning === | ||
− | Toxintester avläses i konverterat mikroskop. Toxinpåverkade celler är | + | Toxintester avläses i konverterat mikroskop. Toxinpåverkade celler är upprundade med karakteristiska taggar. Om minst 50 % av cellerna i brunnen är påverkade, bedöms denna spädning som positiv. Specificiteten konfirmeras med neutralisationstest med specifikt ''C. difficile''-antitoxin före slutlig besvaring. |
− | Toxintest bedöms som korrekt utförd om cellerna i brunnen med den | + | Toxintest bedöms som korrekt utförd om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade och minst 50 % av cellerna i den positiva kontrollens brunnar är påverkade. |
− | Neutralisationstest bedöms som korrekt utförd om den cytopatogena | + | Neutralisationstest bedöms som korrekt utförd om den cytopatogena effekten i den positiva kontrollen neutraliserats i antitoxinspädningarna och om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade. |
==== Preliminär avläsning av toxintest ==== | ==== Preliminär avläsning av toxintest ==== | ||
− | Preliminär avläsning av toxintest görs efter inkubering över natt. | + | Preliminär avläsning av toxintest görs efter inkubering över natt. Toxintest som preliminärt bedöms som negativ inkuberas ytterligare 1 dygn. Om toxintest bedöms som positiv i första eller båda spädningarna, eller är svår att bedöma görs neutralisationstest. |
Rad 64: | Rad 64: | ||
Slutgiltig avläsning av negativ toxintest görs efter 2 dygns inkubering. | Slutgiltig avläsning av negativ toxintest görs efter 2 dygns inkubering. | ||
− | Om toxintest som preliminärt bedömts som negativ bedöms som | + | Om toxintest som preliminärt bedömts som negativ bedöms som positiv i en eller båda spädningarna eller är svår att bedöma görs en titrering och neutralisationstest av provet. |
Nuvarande version från 17 januari 2010 kl. 11.22
Huvudartikel Clostridium difficile
Sekundärartikel till Clostridium difficile-laboratoriediagnostik
Clostridium difficile-cytotoxin; analysprocedur[redigera]
- Dag 1
- Cirka 0,5 mL feces blandas väl med ca 2,5 mL fosfatbuffrad NaCl (PBS).
- Centrifugera (minst 20 min vid 1000-1100 g, eller 5-10 min vid 13000-14000 g).
- För över supernatanten (ospätt prov) till ett tomt rör. Om provet ser grumligt ut filtreras det genom sterilfilter, 0,45 µm.
- Späd provet 1/5 och 1/50 i PBS (t.ex. 1/5 100 µL ospätt prov till 400 µL).
- Kontrollera att cellerna är bra (ej upprundade och ett enkelt, jämnt skikt av celler).
- Sug av mediet från det antal brunnar (2 per prov) som skall användas i cellplattan, inklusive brunnar för negativ och positiv kontroll.
- Tillsätt 100 µL uppehållsmedium i de tömda brunnarna.
- Tillsätt 100 µL av respektive provspädning (Provspädningarna i brunnarna är nu 1/10 och 1/100).
- Inkubera plattan vid 37 °C i 3-10 % CO2 över natt.
Positiv kontroll utgörs av C. difficile-toxin, spätt enligt tillverkarens instruktioner. Det spädda toxinet behandlas som fecessupernatant (ospätt prov).
Negativ kontroll. PBS används som negativ kontroll.
- Dag 2
- Om provet bedöms som positivt i första eller båda spädningarna, eller är svårt eller omöjligt att bedöma, t.ex. om cellerna är upplösta eller hopklumpade görs neutralisationstest.
- Neutralisationstest. Vid neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin görs en titrering av fecessupernatanten för semikvantitering av toxinhalten.
- Antitoxin. C. difficile-antitoxin späds och förvaras enligt tillverkarens instruktioner.
- Späd fecessupernatanten (det ospädda provet) 1/1,25, 1/12,5, 1/125, 1/1250 och 1/12500 i PBS (t.ex. 1/1,25, 200 µL till 50 µL PBS).
- Gör antitoxin provspädningar och PBS-provspädningar i en mikrotiterplatta:
- Antitoxin provspädningar:
- Till vardera 3 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL C. difficile-antitoxin.
- Tillsätt 50 µL provspädning från spädning 1/1,25, 1/12,5 och 1/125 till de 3 brunnarna. Spädningarna är nu 1/2,5, 1/25 och 1/250.
- PBS-provspädningar
- Till vardera 5 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL PBS med mikropipett.
- Tillsätt 50 µL av samtliga provspädningar till de 5 brunnarna.
- Låt antitoxin provspädningarna och PBS-provspädningarna stå i rumstemperatur 20-30 minuter.
- Kontrollera att cellerna är bra.
- Sug av mediet från 8 brunnar per prov i cellplattan, samt 8 brunnar för positiv kontroll och 1 brunn för den negativ kontroll.
- Sätt 150 µL uppehållsmedium till varje brunn.
- Sätt 50 µL av respektive PBS/provspädning (5 st) och antitoxin/provspädning (3 st) till brunnarna. De slutliga PBS/prov-spädningarna är nu 1/10, 1/100 osv., till 1/100.000 och de slutliga antitoxin/provspädningarna 1/10, 1/100 och 1/1000.
- Positiv kontroll titreras och neutraliseras som fecessupernatant. Negativ kontroll som vid provsättning.
- Inkubera plattan i 3–10 % CO2 över natt.
Avläsning[redigera]
Toxintester avläses i konverterat mikroskop. Toxinpåverkade celler är upprundade med karakteristiska taggar. Om minst 50 % av cellerna i brunnen är påverkade, bedöms denna spädning som positiv. Specificiteten konfirmeras med neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin före slutlig besvaring.
Toxintest bedöms som korrekt utförd om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade och minst 50 % av cellerna i den positiva kontrollens brunnar är påverkade.
Neutralisationstest bedöms som korrekt utförd om den cytopatogena effekten i den positiva kontrollen neutraliserats i antitoxinspädningarna och om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade.
Preliminär avläsning av toxintest[redigera]
Preliminär avläsning av toxintest görs efter inkubering över natt. Toxintest som preliminärt bedöms som negativ inkuberas ytterligare 1 dygn. Om toxintest bedöms som positiv i första eller båda spädningarna, eller är svår att bedöma görs neutralisationstest.
Slutlig avläsning av toxintest[redigera]
Slutgiltig avläsning av negativ toxintest görs efter 2 dygns inkubering.
Om toxintest som preliminärt bedömts som negativ bedöms som positiv i en eller båda spädningarna eller är svår att bedöma görs en titrering och neutralisationstest av provet.
Slutlig avläsning av neutralisationstest[redigera]
Positiv neutralisationstest avläses slutgiltigt efter inkubering över natt.
Neutralisationstest som är negativ efter inkubering över natt, avläses slutgiltigt efter 2 dygns inkubering, som antingen negativ eller positiv.