Skillnad mellan versioner av "Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker"

Nuvarande version från 17 januari 2013 kl. 11.28

Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker[redigera]

Bakgrund[redigera]

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. Vid kartläggning av utbrott med MRSA, framförallt med de vanligaste spa-typerna, är komplettering med PFGE ofta användbar.

För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier.

Nedan beskrivs en metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.

Indikation[redigera]

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra olika isolat av MRSA.

Provmaterial[redigera]

Renkultur av Staphylococcus aureus på agarplatta.

Analysprincip[redigera]

Vid PFGE separeras DNA-fragment i en agarosgel med hjälp av en speciell elektroforesutrustning. Den skiljer sig från konventionell gelelektroforesutrustning genom att strömmen istället för att gå i ett jämt flöde skickas pulsvis från elektroder placerade i vinkel. PFGE möjliggör separation av stora DNA fragment och ger lätt analyserbara DNA-bandmönster. Vid PFGE gjuts bakterierna in i en agarosgelplugg i vilken DNA extraheras fram och klyvs till fragment inom lämpligt storleksområde med särskilda restriktionsenzymer. Pluggar med klyvt DNA gjuts in i en stor agarosgel som körs i PFGE-utrustningen. Efter avslutad elektrofores färgas och fotograferas gelen. Gelbilden analyseras visuellt eller med hjälp av dataprogram.

Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens[redigera]

För analysen behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
Referensstam S. aureus NCTC 8325
Gjutformar till agarospluggar
Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
Ultra pure TM agarose Invitrogen
Restriktionsenzym Sma1 med buffert
Gel Red

Analyspocedur[redigera]

DNA-extraktion: Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (cirka 10 $^{9}$ bakt/mL). Efter centrifugering resuspenderas bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.

Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.

Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma1
- 1. Späd buffert (10 μL reaktionsbuffert + 90 μL dest.vatten per isolat).
- 2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
- 3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
- 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
- 5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
- 6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.

Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
- 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
- 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
- 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
- 4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
- 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
- 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
- 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
- 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Gelbilden analyseras.

Analys av bandmönster[redigera]

Isolatens bandmönster jämförs och grad av genetisk likhet analyseras för att styrka/utesluta möjliga epidemiologiska samband.

Om bandmönstren inte går att särskilja eller avviker i <3 bandpositioner, bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung. Skiljer bandmönstren i >3 men <7 positioner bedöms bakterieisolaten som möjligen tillhörande ett utbrott eller ha ett gemensamt ursprung. Om bandmönstren skiljer i >7 band, vilket oftast innebär att cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa.

Observera att det inte finns några absoluta gränser för avvikelsernas antal enligt ovan, och slutbedömningen bör helst vägas mot övriga epidemiologiska data.

REFERENSER[redigera]

1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed Field Gel Electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995; 33:2233-2239

@@ Rad 5: / Rad 5: @@
 och
-''falldefinitionen [[]]''
+''falldefinitionen [[MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)]]''
 ----
 ==Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker==
 ===Bakgrund===
-Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) är en av de äldsta metoder för epidemiologisk som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta ''[[Staphylococcus aureus]]'' (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna  vid utbrott med [[VRE]], invasiva pneumokocker och  olika arter av ''Enterobacteriaceae''. För varje bakterieart måste metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av  bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.
+Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta ''[[Staphylococcus aureus]]'' (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna  vid utbrott med [[VRE]], invasiva pneumokocker och  olika arter av ''Enterobacteriaceae''. Vid kartläggning av utbrott med MRSA, framförallt med de  vanligaste [[Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA|''spa''-typerna]], är komplettering med PFGE ofta användbar.
-Mellan åren 2000 till 2006 typades vid SMI alla insända isolat av MRSA med PFGE och en nationell databas byggdes upp. Sedermera har man övergått att utföra så kallad [[spa-typning]] för epidemiologisk typning av MRSA. I vissa sammanhang, framför allt i samband med   internationella jämförelser av isolat, både inom och utom Europa, kan även en annan typningsmetod, så kallad multi locus secquence typing, ([[MLST]]), användas.
+För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier.
-Nedan beskrivs som exempel på PFGE-analys en klassisk metod för MRSA.
+Nedan beskrivs en metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.
 ===Indikation===
@@ Rad 19: / Rad 19: @@
 ===Provmaterial===
-Renkultur av stafylocker på agarplatta.
+Renkultur av ''Staphylococcus aureus'' på agarplatta.
 ===Analysprincip===
-PFGE baserar sig på att med ''restriktionsenzymer'' klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten med elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt  restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används  restriktionsenzymet ''SmaI''.  Efter avslutad elektrofores färgas gelen  för att visualisera banden av  DNA-fragment av olika storlek  (PFGE-mönster) och avfotograferas. Resultatet databehandlas för att  identifiera likheter och olikheter mellan isolaten. Bakterieisolat av  samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.
-Apparatur
-Termostat 37 och 55°C
+Vid PFGE separeras DNA-fragment i en agarosgel med hjälp av en speciell elektroforesutrustning. Den skiljer sig från konventionell gelelektroforesutrustning genom att strömmen istället för att gå i ett jämt flöde skickas pulsvis från elektroder placerade i vinkel. PFGE möjliggör separation av stora DNA fragment och ger lätt analyserbara DNA-bandmönster. Vid PFGE gjuts bakterierna in i en agarosgelplugg i vilken DNA extraheras fram och klyvs till fragment inom lämpligt storleksområde med särskilda restriktionsenzymer. Pluggar med klyvt DNA gjuts in i en stor agarosgel som körs i PFGE-utrustningen. Efter avslutad elektrofores färgas och fotograferas gelen. Gelbilden analyseras visuellt eller med hjälp av dataprogram.
-Centrifug ≤ 12.000 x g
-Pipett 1-10 µl
-Pipett 1-40 µl
-Pipett 40-200 µl
+====Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens====
-Pipett 200-1000 µl
+*För analysen  behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
-Elektroforesutrustning för PFGE
+*Referensstam ''S. aureus'' NCTC 8325
-UV-bord med kamera
+*Gjutformar till agarospluggar
-Våg 300/3000 g
+*Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl,  EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
-Våg 1 mg- 160  g
+*TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
+*Ultra pure TM agarose Invitrogen
+*Restriktionsenzym ''Sma''1 med buffert
+*Gel Red
-Förbrukningsmateriel och reagens
+====Analyspocedur====
-Ref stam NCTC 8325
-McFarlandrör nr 4
-ml polypropylenrör
-Engångsplatinös
-,5 ml centrifugrör
-Engångstippar till ovanstående pipetter
-Skalpell
-Spatlar
-Petriskål
-Gjutformar till agarospluggar
-Dubbeldetsillerat DNAse och RNAse fritt vatten
-M Tris HCl pH 7,5
-M NaCl
-,5 M EDTA pH 8,0
-LMT agaros (2% I EC buffert) FMC Bioproducts
-Lysostaphin 1 mg/ml i 0,05 M Tris HCl (pH 7,5)
-,15 M NaCl
-Proteinase K (5mg/ml I d.d. sterilt vatten)
-TEN-buffert: 100 mM Tris HCl pH 7,5
+*''DNA-extraktion:'' Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (cirka 10<math>^9</math> bakt/mL). Efter centrifugering resuspenderas bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.
-mM EDTA
-mM NaCl
+Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.
+*'''Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma1'''
+**1. Späd buffert (10 μL reaktionsbuffert + 90 μL dest.vatten per isolat).
+**2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
+**3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
+**4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
+**5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
+**6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
-EC-buffert:   Trizma Hydroklorid 0,95 g
+*'''Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet'''
-                      NaCl 58,4g
+**1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
-Etylendiamintetraättiksyra 29,2 g
+**2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
-Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter 5 g
+**3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
-N-Lauryl-sarcosin 5 g
+**4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
-Natriumdeoxycholat 2 g
+**5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
-Dest vatten ca 800 ml
+**6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
-Ph justeras med ca 50 ml 5 M NaOH till 7,5
+**7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
+**8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Gelbilden analyseras.
+====Analys av bandmönster====
+Isolatens bandmönster jämförs och grad av genetisk likhet analyseras för att styrka/utesluta möjliga epidemiologiska samband.
+Om bandmönstren inte går att särskilja eller avviker i <3 bandpositioner, bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung. Skiljer bandmönstren i >3 men <7 positioner bedöms bakterieisolaten som möjligen tillhörande ett utbrott eller ha ett gemensamt ursprung. Om bandmönstren skiljer i >7 band, vilket oftast innebär att cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa.
-TE-buffert:   10  mM Tris HCl pH 7,6
+Observera att det inte finns några absoluta gränser för avvikelsernas antal enligt ovan, och slutbedömningen bör helst vägas mot övriga epidemiologiska data.
-mM EDTA
+==REFERENSER==
+*1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
-x TBE buffert:
+*2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed Field Gel Electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995; 33:2233-2239
-Trizma base 108 g
-                      Borsyra H3BO3 55,65 g
-                      Titriplex III (Na-EDTA) 7,44 g
-                      Dest vatten till 1000 ml
-Ultra pure TM agarose Invitrogen
-Restriktionsenzym Sma 1 med buffert
-Gel Red
-Analyspocedur
-DNA extraktion
-Över      natt kultur bakterier på agarplatta slammas i 500 µl TEN-buffert till      täthet 1x 109 bakt/ml i centrifugrör, centrifugeras 10 sek x 7000      x g, dekanteras och resuspenderas i 125 µl EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min.Tillsätt      125 µl 55°C      2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert. Tillsätt 12 µl 1 mg/ml lysostaphin,      blanda väl genom att pipettera upp o ner några gånger och gjut agarosen i      pluggformar med hjälp av pipett.Låt      pluggarna stelna i +4°C      10-15 min.Placera      pluggarna från respektive isolat i ett centrifugrör. Oftast gjuts två      pluggar /isolat, med 1 ml EC-buffert och inkubera i 37°C.Dela      en av pluggarna med skalpell i tre delar. Två av bitarna överförs till      nytt rör och 250 µl TE-buffert samt 25 µl proteinase K (5 mg/ml)      tillsätts. Inkubera 1 timma 55°C.Avlägsna      bufferten och tillsätt ny kylskåpskall TE-buffert och detta upprepas 4-5      ggr med 10 min mellanrum. Förvara pluggarna i kyl mellan tvättarna.      Pluggarna kan sparas i kyl i 4 °C någon vecka.
-Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1
-. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
-. Tillsätt 100 μl av ovanstående buffert till varje centrifugrör.
-. Tillsätt 1 μl enzym (= 1Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
-. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
-. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
-. De digererade pluggarana kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
-Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
-. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 ml 0,5 x TBE-buffert
-. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
-. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen. Om gel med 15 brunnar används placeras klyvningar från referensstammen lämpligen i brunn nr 2, 8 och 14.
-. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 l vatten.)
-. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
-. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
-. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
-. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.
 [[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
-[[KAtegori:Smittskyddslagens sjukdomar]]
+[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]