MRSA-screening enligt Halmstadmodellen

Till förgreningssidan MRSA

---

MRSA-screening enligt ”Halmstadmodellen”

Introduktion

Metoden gör det möjligt att utesluta förekomst av MRSA i 80-90 % av negativa prover inom ett dygn. Övriga prover odlas ytterligare ett eller två dygn innan de kan slutsvaras. För att åstadkomma detta odlas provet i en ”semi”-selektiv buljong (2 mg/L meticillin) över natt. Antalet S. aureus celler i buljongen bestäms sedan med en kvantitativ realtids-PCR baserad på nuc-genen. De prover som innehåller S. aureus-antal under en definierad cutoff svaras ut som negativa. Övriga odlas ut på fasta substrat för MRSA-identifiering. Principen bygger på att MRSA anrikas till nivåer över cutoff, känsliga stammar gör detta i mycket mindre utsträckning. ”Semi”-selektiviteten i buljongen betingas av att många MRSA-stammar inte är höggradigt resistenta och alltså inte skulle växa fram i en högre koncentration. Tyvärr innebär det också att vissa mecA-gen negativa S. aureus (BORSA) kommer att växa över ”cutoff” och därmed sänka specificiteten i PCR-steget. Prover svaras dock ut positiva för MRSA endast efter odlingsfynd.

Anrikning och provpreparation

Provpinnen eller 50 µL urin inokuleras i 3-5 mL MAMSA-buljong.

Inkubera också tunt inokulat av MRSA-kontrollstam CCUG35600 i ett rör som positiv preparationskontroll. Inkubera 37 °C i skakinkubator (110 rpm) minst 16 timmar. Efter inkubering vortexas odlingen och 100 µL förs över till sterilt 1,5 mL eppendorfrör. Om prover skall ”poolas” tag 100 µL av varje (högst 3 prover per pool) till ett rör. Centrifugera röret 14 000 rpm 3 minuter och avlägsna genast överfasen. Resuspendera pellet i halva ursprungsvolymen StafLys (20 mM Tris-HCl pH 7,6 (Sigma), 0,5 % Tween20 (Sigma), 0,5 % Igepal CA-630 (Sigma) och 60 µg/mL ProteinasK (Roche Diagnostics)). Inkubera sedan röret 56 °C 60 minuter följt av 5 minuter 95-99 °C. Centrifugera provet 10 000 rpm 1 minut inför PCR-analys.

Mängdstandard

Mängdstandard bereds i korthet från en övernattsodlad BHI-kultur av MRSA CCUG 35600. Med ”viable counts” bestäms CFU/mL för suspensionen varefter celler lyseras på samma sätt som proverna. Lysatet späds sedan i StaffLys utan proteinasK till lämpliga koncentrationer utifrån ”viable count”-resultat (t.ex.108, 106, 105, 104 CFU/mL).

Alternativt kan en mängdstandard beredas från isolerat och koncentrationsbestämt kromosomalt DNA från en S. aureus kontrollstam.

• Recept: MAMSA-buljong
  • Innehåll Gram/L
  • proteos peptone (Oxoid L85) 15,0
  • liver digest (Oxoid L27) 2,5
  • yeast extract (Oxoid L21 5,0
  • NaCl (Merck) 25,0
  • mannitol (Scharlov), 10,0
  • phenyl red (Merck) 16 mg/L
  • Methicillin (LabM) 2,0 mg
  • Aztreonam (Bristol-Meyers Squibb) 8 mg
• pH 7,0 ± 0,1 vid 25 °C

Kvantitativ nuc-PCR

Genom att analysera fyrapunkters mängdstandard parallellt med proverna kan antalet S. aureus-celler/mL i buljongerna bestämmas. Verifiera PCR-produkten med smältpunktsanalys, nuc-PCR-produkt smälter vid ca 82 °C. Buljonger som innehåller färre än 104 CFU/mL svaras ut som negativa, 10 µL av övriga buljonger odlas ut på substrat lämpliga för identifiering av S. aureus.

Reaktionsvolymen är 20 µL, använd 2 µL templat. Mastermixen skall innehålla 1 x LC-master, 4 mM MgCl2, 0,5 µM av varje primer och 0,04 units/µL FastStart Taq DNA-polymeras.

LC-master innehåller 2 x FastStart PCR-buffert (Roche Diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche Diagnostics, 0,04 % (w/v) BSA (Roche Diagnostics) och 0,6 x SybrGreen I (Molecular Probes).

• Primersekvenser
  • F-primer 5´-GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT –3´
  • R-primer 5´- CAA GCC TTG ACG AAC TAA AGC –3´

Forward primer är exakt som referens 1, reverse primer är tre baser kortare än den publicerade sekvensen (modifierad av Anki Pettersson, Lund).

• Temperaturprofil i LightCycler
  • Enzymaktivering- 95 °C 10 minuter. Slope 20 °C/s. 1 cykel.
  • Amplifiering och detektion- 95 °C 15 sekunder. 65 °C 5 sekunder. 72 °C 12 sekunder. 79 °C 5 sekunder med ”aquisition singel”. Slope 20 °C/s på alla segment. 40 cykler.
  • Smältpunktsanalys-95 °C 0 sekunder. 60 °C 30 sekunder. 65 °C 0 sekunder. 95 °C 0 sekunder, slope 0,1 °C/s, ”aquisition cont”. Slope 20 °C/s om inget annat anges.
  • Kylning- 35 °C 30 sekunder, slope 20 °C/s.

REFERENSER

1.Brakstad et al. 1992. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J Clin Microbiol. 30: 1654-1660.

39th Annual Meeting of the Infectious Society of America. 2001. San Fransisco paper n.o. 183: MRSA detection in patients in less than 24 h with a Light Cycler (Roche) real-time PCR-based method. Nilsson, P, & Ripa, T.