PCR-påvisning av Mycoplasma genitalium-bilaga3

Huvudartikel: Mycoplasma genitalium

Sekundärartikel till: Mycoplasma genitalium-laboratoriediagnostik

---

Nukleinsyrapåvisning av Mycoplasma genitalium (ej referensmetod)

Analysprincip

Metoden beskriver analysförfarandet vid nukleinsyrapåvisning med realtids-PCR utförd i LightCycler 1.5 (samma prestanda uppnås i LightCycler 480) (Roche Molecular Biochemicals) och detektion med TaqMan MGB (minor grove binder) probe. Mål-DNA är sekvens på 78 bp inom konserverad del av adhesionsgenen MgPa.

Reagenser

• Probe TaqMan MgPa-380 probe (FAM-ACT TTG CAA TCA GAA GGT-MGB) (Applied Biosystems)

• Primer MgPa-355Forward (5´-GAG AAA TAC CTT GAT GGT CAG CAA-3´)
• Primer MgPa-432Reverse (5´-GTT AAT ATC ATA TAA AGC TCT ACC GTT GTT ATC-3´)

LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes eller LightCycler TaqMan Master eller (Roche)

UNG (Uracil-DNA Glycosylase) (Roche)

LightCycler Capillaries 20 μL (Roche)

Vid extraktion i MagnaPure: DNA Isolation Kit (Roche)

Vid manuell extraktion: Chelex 100 (Bio-Rad Lab. AB), spädd till 5 % (w/v) i destillerat vatten

Analysprocedur

Intern kontroll

• Positiv 1. Extraktionskontroll: Poolade positiva urinprover spädda 1/10 med negativa urinprover. Prepareras och analyserassom patientprover. Notera aktuell ”crossingpoint” vid LC-PCR-körning.
• Positiv 2. Renat DNA isolerat från Mycoplasma genitalium ATCC 33530D, konc 1 ng/μL, spädd till 10-5. Alternativt kan kontroll erhållas från SSI eller genom Kliniskt Forskningscenter US Örebro. Det är en DNA-preparation från M. genitalium spädd 10-5 innehållande 106 genom/mL. Denna späs till att motsvara cirka 5 genom/5 μL.
• Negativ: PCR-rent vatten

Inhibitionskontroll: 4 μL av provtemplat och 1 μL av positiv kontroll sätts till separat kapillär med mastermix.

Provberedning

• Prov utgörs av 5-10 mL förstaportions urin, för kvinnor kompletterad med prov från cervix/vagina. Pinnprov från cervix/vagina sätts i samma rör som urinprovet. Förvara prov i kyl men frys ej. Kan förvaras i kyl i minst 7 dygn.

• Urinprov och cervix/vagina i urin: Skaka prov på vortex och överför därefter 2 mL urin till ett kryorör.

Centrifugera 20 000 g i 10 minuter.

Vid extraktion i extraktionsrobot: Sug av supernatanten av men lämna ca 300 μL av urinen kvar i röret. Slamma upp pelleten i kvarvarande urin och hantera sedan enligt anvisning. Vid manuell preparering: Sug av hela supernatanten och slamma pelleten i Chelex 100-lösning enligt nedan

• Cervix/vagina/uretra prov i 2 SP:

Vid extraktion med robot: extrahera provet efter att det skakats på vortex utan centrifugering enligt anvisning. Vid manuell preparering: Skaka provet på vortex och överför därefter 100 μL till 1,0 mL 0,85 % NaCl i kryorör och centrifugera som urinprov. Sug av supernatanten och resuspendera pelleten i 300 μL Chelex 100-lösning och skaka på vortex 60 sekunder. Inkubera i värmeblock 95-99 0C i 10 minuter. Centrifugera 5 min i 11 000 rpm.

• Provsättning:

Sätt kapillärer i kylblock och pipettera 15 μL mastermix och 5 μL extraherat prov enligt protokoll

Jämförelser Denna realtids-PCR har jämförts genom provutbyte om 55 kliniska prover mellan laboratorierna i Västerås och Falun med jämförbart resultat (22 positiva i Västerås mot 21 positiva i Falun). Metoden används på flera laboratorier i landet och är ursprungligen utvecklad på Örebrolaboratoriet och jämförd mot konventionell PCR på Statens Seruminstitut (SSI) i Köpenhamn.

REFERENSER

1. Jensen JS, Björnelius E, Dohn B et al. Use of Taqman 5´ nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol 2004;42:683-692

2. Edberg A, Jurstrand M, Johansson E, et al. A comparative study of three different PCR assays for detection of Mycoplasma genitalium in urogenital specimens from men and women. J Med Microbiol 2008 Mar; 57(Pt 3):304-9.