Skillnad mellan versioner av "Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
Rad 9: Rad 9:
 
==Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker==
 
==Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker==
 
===Bakgrund===  
 
===Bakgrund===  
−
Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) är en av de äldsta metoder för epidemiologisk som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta ''[[Staphylococcus aureus]]'' (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna  vid utbrott med [[VRE]], invasiva pneumokocker och  olika arter av ''Enterobacteriaceae''. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott med MRSA, framförallt med de  vanligaste [[Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA|Spa-typerna]], kan komplettering med PFGE vara användbar.  
+
Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta ''[[Staphylococcus aureus]]'' (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna  vid utbrott med [[VRE]], invasiva pneumokocker och  olika arter av ''Enterobacteriaceae''. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott med MRSA, framförallt med de  vanligaste [[Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA|Spa-typerna]], kan komplettering med PFGE vara användbar.  
  
 
För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av  bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.  
 
För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av  bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.  
Rad 22: Rad 22:
  
 
===Analysprincip===
 
===Analysprincip===
−
PFGE baserar sig på att med ''restriktionsenzymer'' klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten med elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt  restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används  restriktionsenzymet ''SmaI''.  
+
PFGE baserar sig på att med ''restriktionsenzymer'' klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten genom elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt  restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används  restriktionsenzymet ''SmaI''.  
  
−
Efter avslutad elektrofores färgas gelen  för att visualisera banden av DNA-fragment av olika storlek (PFGE-mönster) och avfotograferas. Resultatet databehandlas för att  identifiera likheter och olikheter mellan isolaten. Bakterieisolat av  samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.
+
Efter avslutad elektrofores färgas gelen  för att visualisera banden av DNA-fragment som separerats efter storlek (ett PFGE-mönster) och fotograferas. Resultatet databehandlas för att  identifiera likheter och olikheter avseende bandens läge hos de olika isolaten. Bakterieisolat av  samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.
  
 
====Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens====
 
====Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens====
Rad 38: Rad 38:
 
====Analyspocedur====
 
====Analyspocedur====
 
   
 
   
−
*''DNA-extraktion:'' Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (109 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenseras bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.  
+
*''DNA-extraktion:'' Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (10<math>^9</math> bakt/mL). Efter centrifugering resuspenseras bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.  
  
−
Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till ett rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.  
+
Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.  
 
*'''Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1'''  
 
*'''Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1'''  
−
 
 
**1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
 
**1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
 
**2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
 
**2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
Rad 60: Rad 59:
 
**8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.
 
**8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.
 
====Analys av bandmönster====
 
====Analys av bandmönster====
 +
Isolatens bandmönster jämförs och epideiologiska samband, det vill säga möjliga eller sannolika släktskap identifieras.
 +
 +
Om bandmönstren är identiska eller bara avviker med <3 band, det vill säga har en överensstämmelse om minst 80 % bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung.
 +
 +
Skiljer bandmönstren med >3 men <7 band bedöms mönstren som möjligen tillhörande ett  aktuellt utbrott eller ha ett gemensamt ursprung.
 +
 +
Om bandmönstren skiljer med >7 band, vilket oftast innebär attt cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa. 
 
==REFERENSER==
 
==REFERENSER==
 +
*1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
 +
*2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulse Field Electrphoresis: Criteria for bacterial wstrain typing. Jof Clin Microbiol, 1995 sept;2233-2239
 
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
 
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
 
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]
 
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]

Versionen från 24 april 2012 kl. 13.38

Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker

Bakgrund

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott med MRSA, framförallt med de vanligaste Spa-typerna, kan komplettering med PFGE vara användbar.

För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.

Nedan beskrivs översiktligt en klassisk metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.

Indikation

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra olika isolat av MRSA.

Provmaterial

Renkultur av stafylocker på agarplatta.

Analysprincip

PFGE baserar sig på att med restriktionsenzymer klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten genom elektrofores i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt restriktionsenzym. För stafylokocker, liksom för VRE, används restriktionsenzymet SmaI.

Efter avslutad elektrofores färgas gelen för att visualisera banden av DNA-fragment som separerats efter storlek (ett PFGE-mönster) och fotograferas. Resultatet databehandlas för att identifiera likheter och olikheter avseende bandens läge hos de olika isolaten. Bakterieisolat av samma ursprung har samma PFGE-mönster och får därmed samma beteckning.

Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens

  • För analysen behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
  • Referensstam S. aureus NCTC 8325
  • Gjutformar till agarospluggar
  • Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
  • TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
  • Ultra pure TM agarose Invitrogen
  • Restriktionsenzym Sma 1 med buffert
  • Gel Red

Analyspocedur

  • DNA-extraktion: Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (10 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenseras bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.

Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.

  • Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1
    • 1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
    • 2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
    • 3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
    • 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
    • 5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
    • 6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
  • Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
    • 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
    • 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
    • 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
    • 4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
    • 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
    • 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
    • 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
    • 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.

Analys av bandmönster

Isolatens bandmönster jämförs och epideiologiska samband, det vill säga möjliga eller sannolika släktskap identifieras.

Om bandmönstren är identiska eller bara avviker med <3 band, det vill säga har en överensstämmelse om minst 80 % bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung.

Skiljer bandmönstren med >3 men <7 band bedöms mönstren som möjligen tillhörande ett aktuellt utbrott eller ha ett gemensamt ursprung.

Om bandmönstren skiljer med >7 band, vilket oftast innebär attt cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa.

REFERENSER

  • 1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
  • 2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulse Field Electrphoresis: Criteria for bacterial wstrain typing. Jof Clin Microbiol, 1995 sept;2233-2239
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Pulsfältgelelektrofores_(PFGE)_av_meticillinresistenta_stafylokocker&oldid=10244"