Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

EJ REDIGERAD

Bilaga 2.1

Tabell 27. Karakteristik för 19 stammar som baserat på mätningar av growth index, värderingar av växtkarakteristika och resultaten av biokemiska tester föreslås som referensstammar vid kontroll av substrat och biokemiskt testbatteri för fecesdiagnostik Förväntad växt på* Förväntad resultat av vissa biokemiska tester**

Nr Bakterier CCUG ATCC CLED XLD Hektoen DC- Hynes CIN Mannit/ Gas LDH/ H₂S OD UREA ONPG Indol MU-CAP Salm Fag Salm PolyO 1 S. Montevideo 21 239 150 100 75 +/g +/+ + - - - + + + 2 S. Typhimurium 31 969 14 028 150 100 75 +/g +/+ + - - - + + + 3 S. ssp III 6 322 13 314 100 100 75 +/g +/+ + - + - + - + 4 S. Typhimurium 41 768 150 75 50 +/0g +/+ + - - - + + + 5 S. Senftenberg 37 886 1000 100 5 +/g +/- + - - - + + +

6 Sh. flexneri 21 251 100 75 75 +/0g -/- - - - + - - - 7 Sh. flexneri 32 079 12 022 100 75 50 +/0g -/- - - - - - - - 8 Sh. sonnei 9 567 9774 400 100 50 +/0g -/- + - + - - - - 9 Sh. sonnei 32 351 25 931 400 100 100 +/0g -/- + - + - - - -

10 Y. enterocolitica 9 82 39A 100 100 100 100 +/0g -/- + + + + Nd - - 11 Y. enterocolitica 8 33 055 27 729 200 100 50 25 +/0g -/- + + - + Nd - - 12 Y. enterocolitica 3 8 233 100 50 50 50 +/0g -/- - + - - Nd - - 13 Y. pseudotuberc 17 342 1000 100 10 250** +/0g -/- - + + - Nd - (+)

14 E. coli 17 620 25 922 1500 0 0 0 +/g +/- + - + + Nd - (+) 15 E. coli 30 600 35 218 200 >50 <2 0 +/g +/- + - + + Nd - - 16 C. braakii 41 766 100 >50 >25 >75 +/g -/- + - + - Nd - - 17 Proteus mirabilis 26 767 29 906 100 >50 >10 0 -/0g -/- + + - - Nd - - 18 P. aeruginosa 551 10 145 100 >25 >10 0 -/0g -/- - - - - Nd - - 19 Ent hirae 1 332 8 043 1500 0 0 0 -/0g -/- - - + - Nd 0växt Nd

• Växten p XLD, DC-Hynes och CIN anges som ungefärligt förväntat minimiantal CFU vid ett inokulat av det antal CFU (tvättade och spädda renkulturer utpipetterade och spridda i 50 l portioner) som anges för CLED-agar. ** Alla tre Y. enterocolitica-stammarna är esulinnegativa.
  • • Efter 2 dygns inkubering. Motsvarande växt förväntas också på MacConkey-agar.

Bilaga 2.1 Referensstammar

För serotypning O4 -S. Typhimurium CCUG 31 969 O7 -S. Virchow CCUG 12 653 O8 -S. Newport CCUG 21283 O9 -S. Enteritidis CCUG 34136 O10 –S. Anatum CCUG 37885 O19 –S. Senftenberg CCUG 37 886

Campylobacter Referensstammar för substratkontroll vid varje gjutning: C. jejuni CCUG 11284A god växt E. coli CCUG 17620 hämmad helt eller delvis

Vid lotkontroll dessutom: C. coli CCUG 11283 god växt

För kontroll av odlingsförfarandet används C. jejuni CCUG 11284A

För identifiering dessutom C. lari CCUG 23947 C. upsaliensis CCUG 19559

Tarmpatogena E. coli Målgener för PCR-screening Kategori Målgen Fenotyp Kontrollstam för PCR ETEC eltB estA LT Sta ATCC 35401 ATCC 35401 EIEC ial Invasivitet ATCC 43893 EPEC eae bfpA Intimin Bfp (LA) ATCC 43887 ATCC 43887 Atypisk EPEC eae Intimin ATCC 43887 EHEC Stx1 stx2 Stx 1 Stx 2 ATCC 43890 ATCC 43889

Negativ kontroll för samtliga PCR, E. coli ATCC 11775

Vibrio cholerae Vibrio cholerae O-1 CCUG 9119 Vibrio cholerae O-139 CCUG 34708

Vibrionaceae Aeromonas hydrophila CCUG 217 Plesiomonas shigelloides CCUG 27761 Vibrio parahaemolyticus CCUG 27761

Helicobacter pylori H. pylori NCTC 11637 (CCUG 17874)

Clostridium difficile C. difficile ATCC 9689 används för kontroll av CCFA-plattor, som jämförelse vid luppmikroskopi, som kontroll på den anaeroba miljön och som kontrollstam vid eventuell resistensbestämning

Kontaminantstammar att använda som referensstammar vid lottestning och fort¬löpande tillverknings¬kontroll av fecessubstrat enligt referensmetodiken . ________________________________________________________________ Förväntad växt 1) på Bakterie CCUG ATCC Karakteristika XLD DC-Hynes CIN

E. coli 17 620 25 922 negativ kontroll <0,1 <0,1 <0,1 E. coli 30 600 35 218 ej fullst inhib >25 <1 <0,1 Citrobacter braakii 41 766 >50 >25 >75 Proteus mirabilis 26 767 24 906 får ej svärma >50 >10 <0,1 Ps. aeruginosa 551 10 145 >25 >10 <0.1 Enterococcus hirae 1332 8043 negativ kontroll <0,1 <0,1 <0,1 ________________________________________________________________ 1) Avser relative growth index (uttryckt i procent) med pipetteringsteknik, d.v.s. antal CFU testagar x100/antal CFU kontrollagar (CLED eller Mac-Conkey)

Matförgiftningsstammar Bacillus cereus CCUG 10 781 Clostridium perfringens CCUG 1795 Staphylococcus aureus CCUG 17 621

Bilaga 2.2 Referenssera

Salmonella Polyvalent O-antiserum (Reagensia AB) Polyvalent H-antiserum (Reagensia AB) Faktorantiserum (Reagensia AB)

Shigella Sh. dysenteriae 1-13 (Reagensia AB) Sh. flexneri (Reagensia AB) Sh. flexneri monoklonaler (Reagensia AB) Sh. boydii 1-18 (Reagensia AB) Sh. sonnei SoR (Reagensia AB)

Yersinia Yersinia O3 och O9 (Reagensia AB)

Vibrio cholerae Vibrio cholerae Polyvalent O-1 (Denka Seiken) Vibrio cholerae O-139 (Denka Seiken)

EHEC Escherichia coli O-157 (Denka Seiken)

Bilaga 2.3 Salmonella-utskick S1-10/2002

Syfte Tidi¬gare SMI-utskick avseende Salmonella-diagnostik har i huvudsak varit inriktade på de kva¬lita¬tiva komponenterna av metodologin. Det nu aktuella ut¬skicket, som finansierats av SMI, var i hu¬vudsak inriktat på den kvantitativa komponenten bland annat för att utröna möjlig-heten att definiera gränsvärden (kalibreringsnivåer) som varje lab bör ha som mål¬sättning att klara.

Panel Panelen bestod av 10 prov i blandkulturer med varierande koncentratio¬ner av målbakterierna och fasta koncentrationer av kontaminanter. Mål¬bakterierna utgjordes av två stammar av Salmo-nella-bakterier. Den ena av dessa, S. Montevideo CCUG 21239, är att be¬trakta som ”normal¬va¬riant” i så motto att den är rela¬tivt lättpåvisad på selektiva agarmedier och har en normal biokemi. Den andra, S. Senftenberg CCUG 37886, växer betydligt sämre än den första stammen och döljer sig lätt i den kontami¬nerande bakgrunds¬floran eftersom den är H₂S-negativ, men poly-O, fag- och MUCAP-positiv. Dessa grundkarakteristika för mål¬bakterierna med tillägget att växt inte kunde förväntas från alla prov be¬skrevs i följe¬brevet.

Samtliga prov innehöll dessutom samma mängd, totalt 106 CFU/mL, av E. coli CCUG 30600, Citrobacter braakii CCUG 41766, Proteus mira¬bi¬lis CCUG 26767 och Enterococcus hirae CCUG 1332. På grund av pa¬nelens höga svårighetsgrad rekommenderades att utstryket skulle ske en¬ligt föreslagen referens¬metodik med primär-, sekundär- och tertiär¬stryk för att öka chansen att erhålla fria kolonier.

Resultat och diskussion Använda substrat (Tabell 28) Vid primärodling använde 26 av deltagande 29 lab XLD-agar, varvid åtta lab bara använde XLD, 15 XLD i kombi¬nation med DC-agar, i kombi¬nation med SSI-agar (1 lab) eller Blå/Drigalski-agar (2 lab). Tre lab an¬vände enbart DC-agar. Uppgift saknades ofta beträffande vilken typ av DC-agar (Leifson eller Hynes) som användes. Samtliga lab an¬vände an¬rikningsbuljong varav de flesta (23 lab) Rappa¬port. Sub¬straten var i stort sett de samma som vid föregående utskick 1998.

Värt att notera är att 6 lab tillverkade egen Rappaportbuljong vilket för just denna buljong enligt litteratur¬uppgifter t.o.m. kan vara att föredra framför något av halvfabrikaten. Fjorton lab anrikade i 37 ºC enligt re¬kommendationer i tidigare referens¬metodik. Denna rekommendation är nu ändrad till 41,5 + 0,5 ºC i 24 timmar un¬der förutsättning att recept en¬ligt ref metodik används, d.v.s. tillsats av MgCl2 * 6H20, 29,0 g/L (mot¬svarade MgCl2 13,4 g/L). Den högre inkubationstemperaturen minskar avsevärt mängden normal¬flora som växer ut vid utsådd efter anrikning.

Isoleringsfrekvens (Tabell 29) Totalt tjugosju av 29 lab isolerade korrekt Salmonella-bakterier från provserie 1-5 (S. Senftenberg). Att så många lab lyckades identifiera Salmonella från denna serie skiljer sig radikalt från resultatet 1998 då en¬dast 4/25 lab klarade detta. Skillnaden torde förklaras av att man denna gång var för¬beredd på möjligheten av svårdiagnostise¬rad Salmo¬nella, ef¬tersom koncentrationerna av mål¬bakterierna i 1998 års utskick var de samma som i prov 3 och 4 i det nu aktuella. Liksom vid fö¬re¬gående till¬fälle 1998 lyckades samtliga lab identifiera Sal¬monella-bak¬terier som i aktuellt ut¬skick fanns i provserie 6-10 (S. Montevideo).

Primärodling på fast medium Det framgår av tabell 29 att de två serierna innehöll stigande koncentratio¬ner av respektive mål¬bakterie. Be¬träffande S. Senftenberg lyckades 21 av de 29 laboratorierna isolera denna redan från någon av pri¬märplattorna i något eller flera av proven. De flesta (15 lab) hit-tade den därvid för¬sta gången i prov 4, d.v.s. vid kon¬centrationen 4,4x104 bakterier/mL och tre lab hittade den redan i prov 3, mot-svarande 6,0x103 bakterier/mL. Detta innebär kumulativt att 18 av de 21 laboratorierna som påvisade bakterien på någon av primär-plattorna hade gjort detta vid konc 4,4x104 bakterier/mL.

S. Montevideo var uppenbarligen lättare att isolera från primär-plattorna. Alla lab klarade detta. Sex isole¬rade bakterien redan i någon av de lägsta koncentrationerna (<1-101 bakterier/mL) vil¬ket måste be-tecknas som mycket bra. Vid koncentrationerna 2,7x102 (prov 8) och 2,6x103 (prov 9) bakterier/mL hittade 12 och 9 lab bakterien första gången, kumulativt re¬sul¬tat framgår av tabellen. Dessa nivåer befinner sig i området för den teoretiska nedre gränsen för vad som är möjligt att påvisa med nuvarande metodik (d.v.s. ca 103 Sal¬monella/gram feces). Vi konstaterar alltså att mot den identiska bakgrundsfloran kunde ”normal” H₂S-bildande Salmo¬nella identifieras på primärplattorna i koncentrationer som låg drygt två tiopotenser lägre än för svårodlad H₂S-negativ Salmonella.

Panelens utformning tillåter inga slutsatser beträffande effektiviteten hos olika agarkombinatio¬ner. Där hänvisar vi till resultat av tidigare Salmo¬nella/Shigella-utskick som talar för kombina¬tion av XLD och DC.

Anrikning Betydelsen av men också begränsningarna med anrikningsförfarande illustrerades tydligt av den aktu¬el¬la panelen. Antalet lab som isolerade S. Senftenberg ökade från 21 till 27 efter anrikning. Sex lab isolerade bakte¬rierna i en koncentration som var lägre än den som redan blivit positiv på någon av primärplattorna. Detta är en statistisk signifikant (p<0,007) sänkning av detektionsnivån för dessa lab jämfört med pri¬märodlingen. Tio lab kunde dock inte isolera denna bakterie efter an¬rikning. Detta talar för att S. Senftenberg anri¬kas dåligt eller inte alls (vilket också visats på Västeråslaboratoriet inför utskicket). Den ökade totala iso¬lerings-frekven¬sen efter anrikningsförfarande beror troligen på inhibition av kontami¬nenterna så att mål¬bakterien lättare kunnat iden¬tifieras. Det kumulativa resultat av anrikningsförfarandet framgår av ta¬bell 29. Tjugotvå lab kunde isolera S. Montevideo efter anrikning vid koncentrationer <1-101 bakterier/mL. Sänkningen jämfört med detek-tionsnivån för primärplat¬torna är höggradigt signifikant (p<0,001). Vi ser alltså att känsligheten ökar med mer än en tiopotens efter an¬rikning ner till enstaka bakte¬rier/mL.

Materialets storlek tillåter inte påvisandet av eventuella skillnader mel-lan olika buljonger eller inkube¬ringstemperaturer. Vi förordar dock Rappaport-Vassiliadis (RVS)-buljong som inkuberas i 41,5 °C +- 0,5 ºC i 24 timmar. Om man höjer temperaturen till 43 ºC eller använder högre magne¬siumkoncentration än den angivna rekommenderas 48 timmar in¬kubering.

Lämpliga gränsvärden (kalibreringsnivåer) som varje labo¬ratorium bör klara med panelens två referens¬stammar kan anges till ca 104 bakte-rier/mL för S. Senftenberg och ca 10 bakterier/mL för S. Montevideo.

Primärdiagnostik Salmonella (Tabell 30) I tabell 30 listas den angivna metodiken för verifiering av Salmonella-isolat vid våra laboratorier. Tju¬gotvå lab angav därmed föreslagen refe¬rensmetodik och 19 angav dessutom andra ej kommersiella tester. Det rör sig därvid oftast om OD- och rörlighetstest vilket ju är relevant dels för diag¬nostiken av S. Typhi (OD-ne¬gativ) men också för Shigella (S. sonnei OD-positiv) vilka alla är orörliga. De flesta (25 lab) verifierade rutin¬mässigt fynd av Salmonella med agglutination i polyvalent O-anti¬serum. Enligt den nu aktuella refe¬rensmetodiken räcker biokemisk diagnostik i normalfallet medan poly O bör användas som verifiering vid atypiska biokemiska utfall. Många (19 lab) använde också aggluti¬nation med poly H och serotypade dessutom sina fynd. Användandet av Salmonella fag (i referensmetodi¬ken angivet som alternativ till ag¬gluti¬na¬tion i poly O) var utbrett liksom bruket av API i oklara situationer. Slutligen använde fem lab MUCAP-test, en test med hög känslighet och specificitet vi påvisan¬det av Sal¬monella som vi gärna vill rekom¬mendera, särskilt för att ute¬sluta Salmonella vid atypisk biokemi.

Resistensbestämning av Salmonella-isolat Resistensbestämning utfördes av alla 29 lab men bara på begäran av 18 av dessa. Det framgick tyvärr inte huruvida lab rutinmässigt också sva¬rade ut resultat av resistensbestämning till klinikerna. RAF re-kommen¬de¬rar inte ru¬tinmässig resistensbestämning av Salmonella-isolat. Vid even¬tuell resistensbestämning av Salmonella och Shigella anges som minimi¬urval parenteralt cefalo¬sporin, kinolon, pivmecillinam och tri¬metoprim-sulfa. Denna rekommendation följdes i prin¬cip av laborato¬rierna, ofta med tillägg av ampicillin och ibland kloram¬fenikol. Re¬sistensbestämning av Salmonella är särskilt aktuell vid septisk sprid¬ning eller inför behand¬ling vid långvarigt smittbärarskap hos vuxna (> 6 månader).

Tabell 28. Fasta substrat för primärisolering vid 29 svenska laborato-rier år 2002.

Fasta substrat Antal lab

XLD enbart 8 XLD + DC 15 XLD + SSI 1 XLD + Blå/Drigalski 2 DC (Leifson eller Hynes) enbart 3 För anrikning används: Rappaport (23), Selenit (4), annan bul¬jong/metod (2).

Tabell 29. Isoleringsfrekvenser av två olika Salmonella-stammar före och efter anrikning. Antal laboratorier (n=29) som påvisat Salmonella (kumulativt)

Prov Bakterier* CCUG Antal bakt/mL I primär-odling Efter an-rikning Totalt

1 S. Senftenberg 37 886 4,0x101 - 5 5 2 CO: 1, 3, 19 9,5x102 - 6(p<0,007) 6 3 6,0x103 3 8 11 4 4,4x104 18 16 24 5 4,0x105 21 19 27

6 S. Montevideo 21 239 <1 2 6 6 7 CO: 6, 7 101 6 22(p<0,001) 23 8 2,7x102 18 26 28 9 2,6x103 27 28 29 10 1,4x104 29 28 29 * Samtliga prov innehöll dessutom E. coli, Citrobacter braakii, Proteus mirabilis och Enterococcus hirae, totalt 106/mL.

Tabell 30. Primärdiagnostik av Salmonella vid 29 svenska laboratorier år 2002.

Metod Antal lab

Biokemi enligt referensmetodik 22 Biokemi annan 19 Agglutination poly O 25 Agglutination poly H 19 Serotypning 21 Salmonella fag 25 MUCAP 5 Kommersiell analysbricka (API) 22 Resistensbestämning utfördes av alla, 18 bara på begäran.