Tuberkulos och mykobakterios-laboratoriediagnostik

Huvudartikel: Tuberkulos (tidigare Referensmetodik:Mykobakteriologisk diagnostik)

och

Atypiska mykobakterier

---

Laboratoriediagnostik av tuberkulos och mykobakterios

Allmänt

Odling är referensmetod. Det är viktigt att erhålla isolat för resistensbestämning och epidemiologisk typning. Odling av tuberkelbakterier kräver tillgång till säkerhetslaboratorium klass III enligt gällande föreskrifter från Arbetsmiljöverket.

Referensmetodik

Odling

Odlingsförfarandet är utformat så att växt av både MTB och NTM gynnas.

• Referenssubstrat: Löwenstein-Jensen (LJ) äggbaserat fast medium med glycerol eller natriumpyruvat (se Tuberkulos-Bilaga 6). För flytande odling finns kommersiella Middlebrook-buljonger av typ Bactec 7H13A.

• Homogenisering, dekontamination och koncentrering: Prov som normalt är kontaminerade med normalflorans snabbväxande bakterier (t.ex. sputum) dekontamineras och digereras med nariumlaurylsulfat och natronlut enligt nedan. Ev. tillsätts 200 mg acetylcystein/mL för bästa slemupplösning.

• Natriumlaurylsulfatbehandling
  • 1. För över upp till 2 mL prov till ett 10 mL centrifugrör.
  • 2. Tillsätt 3 mL 3 % natriumlaurylsulfat.
  • 3. Skaka röret 3 ggr med Vortex under 20 min.
  • 4. Centrifugera vid minst 3000 x g 20 min.
  • 5. Spara pellet inklusive 0,5 mL vätska.
  • 6. Neutralisera till gult omslag med 0,09 % svavelsyra med bromkresolpurpur.
  • 7. Tvätta ev. med ca 10 mL PBS om så behövs för fortsatta laborationer. Centrifugera då vid 3000 x g 15 min.

I fall då centrifug för 50 mL rör finns är det fördelaktigt att öka provmängden och justera tillsatserna i enlighet med den faktiska volymen prov. (Reagens se Tuberkulos-Bilaga 6).

Undvik förlängd expositionstid för lut, viabiliteten hos mykobakterierna kan minska.

• Kontaminerade prov i större mängd (t.ex. urin, ventrikelsköljvätska): Proven bör centrifugeras, helst i 50 mL rör. Om detta ej är möjligt kan sedimentering i kylskåp 12-24 tim ge en viss anrikning av bakterier. I vissa fall kan t.ex. 5 x 10 mL rör användas.

Från bottensatsen överförs 1-2 mL till centrifugrör, varefter natriumlaurylsulfatbehandling utförs enligt ovan.

• Kroppsvätskor från normalt sterila lokaler (t.ex. pleuravätska). Om viskösa: natriumlaurylsulfatbehandling enl ovan.

Vid stora mängder bör centrifugering ske före odling och ev. behandling. Om provet misstänks vara kontaminerat odlas över natt på hematinagar och ev. laurylsulfatbehandling om osterilt.

• Vävnad, biopsier.
  • 1. Provet homogeniseras i steril mortel.
  • 2. 1 mL PBS tillsätts.
  • 3. Skakas i Vortex.
• Blod: För ändamålet avsedda buljongflaskor inokuleras med blod av provtagaren.
• Benmärg: Ingen förbehandling. Koagel homogeniseras i mortel.

Isolering

0,3-0,5 mL av provmaterialet inokuleras på två LJ-rör, ett med glycerol och ett med natriumpyruvat som kolkälla. Till ett rör sätts vid behov en lämplig antibiotika¬kombination för att undertrycka kontaminerande flora, t.ex. PANTA (Becton Dickinson). Inkubation sker under 7 veckor i 37 °C.

Prov från ytliga lokaler (körtelbiopsi, sår, hud) inkuberas på ytterligare två rör enligt ovan, och inkuberas i 30 °C (för växt av M. marinum och M. ulcerans).

Prov från normalt sterila lokaler inkuberas i Middlebrook-buljong. I sådana fall måste laurylsulfatbehandlat material sköljas med PBS (se ovan) då växten i buljong hämmas av laurylsulfatet.

Blod/benmärg inokuleras i blododlingsbuljong, upp till 5 mL av provet. Supplement som tillhandahålls av tillverkaren tillsätts på laboratoriet. Lymfocyter i blodet kan ge ett visst utslag som om växt skulle förekomma i buljongen.

Feces. Två droppar extra antibiotikalösning (PANTA) kan droppas på substratet för att hindra kontamination.

Avläsning

LJ-rör inspekteras minst varje vecka under 7-8 veckor. Preparat görs från misstänkta kolonier för auraminfärgning.

Kolonimorfologin varierar mellan arterna och inom art beroende på tillväxtbetingelserna från ‘smooth’ till ‘rough’. Kolonierna kan vara opigmenterade (från svagt gulvita) till beige, gula och mera sällan skära till orange. Pigment kan bildas i mörker (skotokromogena) eller endast vid belysning (fotokromogena). Tillväxten är långsam med generationstider 2-20 tim. Synliga kolonier kan observeras efter ca 2-7 dagar (snabbväxare) eller 10 dagar - 8 veckor (långsamväxare). Optimal temperatur för tillväxt varierar från 30 °C (M. marinum, vissa M. avium) till 45 °C (M. xenopi). De flesta arter växer på Middlebrook-buljonger eller äggsubstrat (Löwenstein-Jensen), vissa kräver tillsats av hemin, mykobaktiner eller andra tillväxtfaktorer.

Buljongodlingssystem som BACTEC, MGIT och BacT/Alert bygger på olika principer för (automatisk) detektion av mykobakterieväxt. De moderna systemen rapporterar direkt till centraldator samt larmar vid positiv växt. Inkubation under 6 veckor är standard. Alla tre systemen detekterar på ett fullgott sätt växt av mykobakterier förutsatt att laurylsulfat från förbehandling avlägsnats från provet.

Identifiering och minimikriterier

Mycobacterium tuberculosis-komplexet

Växt av cordbildande syrafasta bakterier på Löwenstein-Jensen-substrat eller Middlebrook-buljong. Positiv DNA-hybridisering (>60 000 RLU) med MTB-komplexet-probe (Accuprobe, Gen Probe).

M. tuberculosis är normalt in vitro resistent mot tiophen-2-carboxylsyrahydrazid (TCH) 5 mg/L och känslig för pyrazinamid, även om avvikelser (TCH =S) eller (PZ = R) förekommer.

M. bovis är alltid TCH-känslig och PZ-resistent. M. bovis-BCG fordrar molekylär typning för säker diagnos.

Konfirmering av M. bovis och BCG kan ske med spoligotypning (Smittskyddsinstitutet). Diagnostiskt kit, som med omvänd hybridisering kan påvisa M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum I m.fl. från renkultur finns på marknaden, men är ännu ofullständigt utvärderat (Genotype, Hein GmbH).

M. avium-intracellulare-komplexet (MAC)

Växt av icke-cordbildande syrafasta bakterier på Löwenstein-Jensen- eller Middlebrook-substrat. Positiv DNA-hybridisering (> 60 000 RLU) för MAC med Accuprobe (Genprobe). Övriga icke-tuberkulösa mykobakterier. Artbestämning sker, främst med molekylära metoder, vid hänvisningslaboratorium.

Alternativa diagnostiska metoder

Mikroskopi

Auramin¬färgning med fluorescens används vanligen för både sputummikroskopi och undersökning av kulturer. Färgen kan inte avlägsnas med syra-alkohol, vilket gett upphov till beteckningen ‘syrafasta bakterier’. Ziehl-Neelsen-färgning är ett alternativ, som möjliggör avläsning i vanligt ljusmikroskop. Det går lättare och snabbare att upptäcka bakterierna med fluorescensmetoden. Syrafastheten kan delvis gå förlorad i vissa faser av tillväxt, och är inte sällan partiell på snabbväxande icke-tuberkulösa mykobakterier.

Mikroskopisk undersökning av sputum är en snabb, enkel och säker diagnostisk metod. Det krävs ca $10^{4}$ mykobakterier per mL sputum för positivt resultat, varför mikroskopi ensamt inte är tillräckligt känslig för diagnostik av mykobakterie-infektion, utan denna bör alltid kompletteras med odling.

Smittsamhetsbedömning görs med mikroskopi av icke anrikat sputum, och är naturligen av störst intresse före behandling, men kan också ge indikation på återfall om bakterieantalet ökar kraftigt under behandling. Sensitiviteten jämfört med odling är ca 25 % om icke anrikat sputum används och ca 50 % om sputum förbehandlas och centrifugeras. Specificiteten är vanligen > 99 % men kan sjunka vid < 15-25 mikroskopier per vecka.

Man kan inte med mikroskopi differentiera mellan M. tuberculosis-komplexet och NTM. Det är fördelaktigt att utföra PCR för MTB vid fynd av syrafasta bakterier i luftvägssekret för att klarlägga arten infektiöst agens, TB eller NTM. Positiv mikroskopi kombinerat med negativ PCR för MTB skall tolkas som NTM-infektion.

OBS att mikroskopi på BAL inte ger tillförlitlig smittsamhetsbedömning, den bör göras på sputum. OBS att utanför tbc-lab framställda glas för mikroskopisk undersökning av mykobakterier ej bör mottagas då kvaliteten kan vara undermålig. OBS att risken för kontamination av provet med ovidkommande mykobakterier bör beaktas. Källor för kontamination kan vara t.ex. kranvatten, (M gordonae m.fl.), färgvätskor och immersionsolja.

• Homogenisering av prov: Prov bör homogeniseras och koncentreras med centrifugering >3000 x g för att öka sensitiviteten av mikroskopi och odling. Viskösa prov görs flytande genom behandling med t.ex. natriumlaurylsulfat och acetylcystein (se nedan under primärisolering).

• Utstryk och fixering: Utstryk prepareras på vanligt sätt och fixeras genom upphettning i 80 °C 2 timmar eller med gaslåga.
• Fluorescensfärgning med auramin: Fixerade preparat inkuberas i 0,3 % auraminlösning 15 min i kuvett med lock. Skölj med kranvatten. Avfärga med syra-alkohollösning 10-15 min. Skölj med kranvatten.

Kontrastfärga med 0,5 % natriumpermanganat i vattenlösning 30 sek, skölj med vatten. Låt preparaten lufttorka ev. i termostat.

Reagens se Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept.

För färgning används väl rengjorda kyvetter. Preparat från kulturer blandas ej med dem för sputummikroskopi för att minimera kontaminationsrisken.

Auramin står på Arbetsmiljöverkets lista över carcinogena ämnen. Lösning i koncentration < 1 % får användas utan tillstånd men skall hanteras med försiktighet. Använd handskar och undvik hudkontakt. Kontaminerade kläder tas omedelbart av och exponerade hudpartier sköljs med rikligt vatten. Spill i lokalen skall saneras. Kontaminerat avfall samlas i papperspåsar för destruktion. Använd auraminlösning hälls i särskild flaska som går till destruktion via riskavfallstransport. Kärl innehållande auraminlösning hålls väl tillslutna och märks ”cancerrisk”.

Avläsning

Screening av preparatglas kan ske vid lägst 250 x med okular x10-12. UV- eller blåljus från 50w Hg-lampa med BG 12 primärfilter används för auramin. Granska minst 35 synfält. Använd större förstoring för att identifiera misstänkta mykobakterier (”beading” i MTB, se t.ex. ASM-manual).

Kvalitetskontroll

En standardiserad preparatkontroll inkluderas vid varje färgningstillfälle. M. gordonae eller annan apatogen art rekommenderas.

Molekylärbiologiskt påvisande

Direktpåvisning av M. tuberculosis-komplexet med polymeraskedjereaktionen, PCR, eller liknande molekylärbiologiska metoder, har etablerats som viktiga snabb¬diagnostiska metoder, särskilt av lungtuberkulos. Sålunda visades redan 1993 med PCR sensitivitet 83 % och specificitet 99 % gentemot odling för luftvägsprov. Liknande siffror har redovisats från Norden. Samma metoder kan användas för serösa sekret och även vävnadsprov. Särskilt i de senare är bakteriemängden ofta låg och inhibitorer kan störa reaktionen, varför sensitiviteten är relativt låg.

Eftersom bakterier som är döda eller har nedsatt viabilitet kan påvisas med PCR kan odlingsnegativa prov vara sant PCR-positiva. Stabiliteten hos DNA möjliggör detektion av tuberkelbakteriers DNA i formaliniserade prov och även i t.ex. luftvägsprov flera månader efter insatt tuberkulosbehandling.

PCR görs på alla mikroskopipositiva prov, men också på begäran av klinikern, samt på alla likvorprov (OBS 5 ml likvor fordras för optimal diagnostik!). Prov under terapi är ej indicerat. Sensitiviteten för luftvägsprov är 90 % jämfört med odling, för vävnad, sekret och exkret 50-60 %. Specificiteten är 99-100 %. Negativ PCR utesluter således ej tbc! Inhibitorer i sekret och vävnader kan minska sensitiviteten i PCR. Sköljning av materialet med PBS kan avlägsna inhiberande substanser. Även i likvor finns inhibitorer varför spädning och centrifugering bör ske.

PCR-tekniken är krävande trots att utmärkta kits finns på marknaden. Strikta rutiner för att hindra kontamination av laboratoriet med den aktuella genetiska sekvensen är av största betydelse. Om kontamination inträffar tvingas man oftast byta till annan teknik. PCR bör endast utföras i laboratorier som har resurser för samtidig myko¬bakterieodling, så att kontinuerlig jämförelse av resultaten kan ske. Slutlig bakteriologisk diagnostik med differentiering inom M. tuberculosis-komplexet kan för närvarande inte ske utan odling. Resistensbestämning sker heller vanligen inte utan odling (undantag molekylärbiologisk påvisning av rifampicinresistens - rpoB-genen). Med risk för förekomst av resistent M. tuberculosis bör odling och resistensbestämning aldrig underlåtas på fall av misstänkt tbc.

Resistensbestämning

Resistensbestämning av MTB-komplexet

Vilda stammar av MTB som inte mött något tbc-läkemedel är konstanta i sin känslighet för dessa. Dock föreligger en mutationsfrekvens på $10^{7}$- $10^{8}$, olika för olika medel. Resistensutveckling i bakteriologisk mening uppkommer genom selektionstryck vid inadekvat terapi, varvid den resistenta bakteriepopulationen snabbt kommer att dominera. Därför måste kombinationsbehandling ges. Kombinationen av två medel mot vilka mutationsfrekvenserna för resistens är $10^{7}$ och $10^{8}$ ger en summationseffekt = $10^{1}$$^{5}$, varvid mutation för båda medlen blir så sällsynt att den saknar klinisk betydelse.

Samlad klinisk erfarenhet av tbc-behandling har visat att denna blir effektiv om frekvensen resistenta mutanter i bakteriepopulationen understiger 1 % för vart och ett av de ingående medlen. För praktiskt bruk tillämpas därför gränsen 1 % vid in vitro resistensbestämning för tuberkulostatika. Följande medel är förstandsval: streptomycin, isoniazid, etambutol, rifampicin, pyrazinamid. Om resistensbestämning mot andrahandsmedel utom amikacin och ofloxacin, eller tredjehandsmedel och andra ovanliga substanser önskas, bör detta ske på landets referenslaboratorium, SMI.

• Proportionsmetoden: Denna metod mäter om proportionen resistenta/känsliga TB-bakterier är >1 % eller <1 %. Om den är >1 % anses resistens föreligga, om <1 % är stammen att anse som känslig. Proportionsmetoden utförs vanligen på 7H10-agar med läkemedel tillsatt i relevanta koncentrationer, och är av WHO accepterad referensmetod.

Proportionsmetoden med BACTEC-teknik för MTB-komplexet. Bactec-systemet (Becton Dickinson) har i många undersökningar givit resultat i resistensbestämning likvärdiga med standard-proportionsmetoden. Detektion av bakterieväxt sker genom påvisning av från substratet frigjord 14CO₂. Metodiken är snabb och känslig för påvisning av mykobakterier och för resistensbestämning.

Mediet är flytande Middlebrook 7H9 anrikat med albumin, katalas, kasein och 14C palmitinsyra; pH är 6,8 utom för pyrazinamid där det är 6,0. Slutkoncentrationen isoniazid är 0,1 (och 1,0 mg/L), rifampicin 2,0, etambutol 5,0 och pyrazinamid 100 mg/L (amikacin 1,0 och ofloxacin 2,0 mg/L). Varje flaska med läkemedel samt en kontrollflaska inokuleras med en standardiserad bakteriesuspension, dessutom en kontrollflaska med spädning 1/100. Inokulatet kan beredas direkt från kolonier på fast medium, men även direkt från växande kultur i flytande medium, (Se BDs manual). Det är viktigt att inokulaten är exakt avvägda då för stora inokulat kan ge falsk resistens. Nefelometer rekommenderas för kontroll av bakteriesuspensionens täthet. Tolkningen baseras på den dagliga förändringen i tillväxt.

Skillnad vid optimal växt (dag 3-4) i GI hos 1/100 spädningen av kontroll > skillnaden i GI hos ett läkemedel indikerar att stammen är känslig. Om skillnaden i tillväxt hos 1/100 kontrollen < skillnaden i GI hos ospädd suspension med ett läkemedel indikerar detta att stammen är resistent. I sådana fall rekommenderas att resistensbestämningen upprepas. Tolkningsmallar finns i BDs manual.

Här erinras om att bovina stammar är naturligt resitenta mot pyrazinamid.

Resistensbestämning av NTM

• Resistensbestämning av långsamväxande NTM med BACTEC. NTM har ett begränsat spektrum av känslighet mot antimykobakteriella medel. Resistensbestämning av NTM bör endast göras om terapi planeras. Det är inte självklart att alla funna NTM skall behandlas. Vid fynd av NTM i luftvägarna kan man t.ex. välja avstå behandling hos patienter med begränsade symtom och hög ålder. NTM i halslymfkörtlar hos barn behandlas parktiskt taget aldrig med antimykobakteriella medel.

BACTEC-systemet används för resistensbestämning av långsamväxande NTM när så är påkallat. Tekniken är inte lika väl förankrad i den kliniska verkligheten som resistensbestämningen av förstahandsmedlen mot MTB, varför resultaten bör ses som en riktningsangivelse för terapin. En framgångsrik terapi bör t.ex. inte ändras p.g.a. att stammen befinns vara resistent mot ett av de ingående medlen. Synergism in vitro kan ofta påvisas mellan etambutol och t.ex. rifampicin och/eller ofloxacin på MAC-stammar, vilket antyder att hela behandlingen bör bedömas och inte enbart varje medel för sig. NTM-stammar späds vanligen 1/10 jämfört med MTB-komplexets bakterier, för övrigt samma metodik som för MTB. Det är särskilt viktigt att inokulaten är exakta, annars kan otillförlitliga resultat erhållas. Denna typ av resitensbestämning bör ej utföras av laboratorier som har lågt antal NTM-stammar eller eljest har begränsad erfarenhet av tekniken.

• Resistensbestämning av snabbväxande NTM med Etest. Etest kan användas för resistensbestämning av snabbväxande NTM (M. chelonae, M. fortuitum) men metodiken är inte fullt internationellt accepterad, och korrelationen mellan in vitro fynd och in vivo effekt är inte helt klarlagd. Följande medel rekommenderas för undersökning: Amikacin, ofloxacin, klaritromycin, rifampicin, cefoxitin, doxycyklin, imipenem, trimetoprim-sulfa. Etambutol saknar i allmänhet effekt på snabbväxande NTM.

Epidemiologisk typning

Molekylärepidemiologisk typning med RFLP (restriktions-fragment-längd-polymorfism) av Mycobacterium tuberculosis-komplexet sker för att kartlägga smittkedjor och uppkomna kluster av tuberkulosfall. För detta sänds väl utvuxna förstagångsisolat från varje patient på fast substrat till Smittskyddsinstitutet. (Ev. omstickning på SMI fördröjer analysen ca 4 v.).

Isolat erhållna vid behandligssvikt, recidiv eller befarad reinfektion bör också undersökas. Förutom patientens ID, provtagningsdatum, och provets ID, bör även provmaterial, resultat av mikroskopi och resistensbestämning meddelas, enklast genom att skicka med en kopia av laboratoriets slutsvar.

Resultaten av RFLP för ett isolat redovisas som graden av identitet (ID) med den befintliga RFLP-databasen eller med ett givet prov:

• 100 % ID: stammarna tillhör ett kluster, epidemiologiskt samband är sannolikt.
• >90 % ID: epidemiologiskt samband kan inte uteslutas.
• <90 % ID: unikt mönster, inget epidemiologiskt samband.

Vid förekomst av < 5 band i RFLP kompletteras undersökningen med spoligotypning. Vid identiskt spoligotypningsmönster rapporteras att stammarna tillhör ett kluster.

Information om RFLP-resultat meddelas till:

• Insändande laboratorium,
• SMI epidemiologiska enheten, som meddelar
• vederbörande smittskyddsläkare,
• som kontaktar vederbörande kliniker i fall av klusterbildning.

Om flera smittskyddsläkare involveras samordnar Statsepidemiologen utredningen.

Kvalitetskontroll

• Referensstammar:
  • M. tuberculosis ATCC 27294,
  • M. bovis ATCC 19210,
  • M. avium ATCC 25291.

BCG, stam Copenhagen, BCG-vaccin, Statens Serum Institut, se FASS För icke-tuberkulösa mykobakterier rekommenderas att alla arter som resistensbestäms åtföljs av en ATCC-stam av samma art.

Svarsrutiner

Mikroskopi

Provet rapporteras som positivt i mikroskopi om syrafasta bakterier påträffas i preparatet. Antalet bakterier kan vara ett grovt mått på effekten av behandling, men utsöndringen är intermittent. Därför är detaljerad kvantifiering vansklig och förutsätter höggradig standardisering.

• Standardsvar vid positivt utfall:
  • Mikroskopi: Förekomst av mykobakterier.
    • Förekomst av <10 bakterier kan rapporteras ”Sparsam förekomst av mykobakterier”.
    • Vid > 10 bakterier /synfält kan rapporteras ”Rikligt mykobakterier”.
• Standardsvar vid negativt utfall:
  • Mikroskopi: Inga mykobakterier. Metodkänsligheten är 50 % (gäller anrikade diagnostiska prov).

Odling

Fynd av syrafasta stavar med för mykobakterier typiskt koloniutseende svaras:

• Växt av mykobakterier, artbestämning pågår. Senare t.ex. Växt av M. tuberculosis, resistensbestämning följer.
• Negativ odling svaras: Ingen växt av mykobakterier.

Laboratorierapportering

Infektion med M. tuberculosis regleras av smittskyddslagen - Allmänfarliga sjukdomar och infektion med Mycobacterium species av smittskyddslagen - övriga anmälningspliktiga sjukdomar.

REFERENSER

• Huard R C, de Oliviera Lazzarina L C, Butler W R, van Soolingen D, Ho L H. 2003. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions. J Clin Microbiol. 41:1637.

• Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutierrez C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS, Samper S, van Soolingen D, Cole ST. 2002. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 3684-9.

• Cavanagh R, Begon M, Bennett M, Ergon T, Graham IM, De Haas PE, Hart CA, Koedam M, Kremer K, Lambin X, Roholl P, Soolingen Dv D. 2002. Mycobacterium microti infection (vole tuberculosis) in wild rodent populations. J Clin Microbiol. 40:3281-5.

• DeBoer A S, Blommerde B, de Haas P E W, Sebek MMGG, et al. 2002. False-positive Mycobacterium tuberculosis cultures in 44 laboratories in the Netherlands (1993-2000): Incidence, risk faktors, and consequences. J Clin Microbiol. 40: 4004-9.

• Canetti G, Froman S, Grosset J et al. 1963. Mycobacteria:laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull WHO. 29: 565-78.

• Inderlied C. Antimycobacterial agents: In vitro susceptibility testing, spectrums of activity, mechanisms of action and resistance, and assay for activity in biological fluids. In: Antibiotics and Laboratory Medicine, V Lorian Ed. Williams & Wilkins 1996.

• Woods G L, Bergmann J S, Witebsky F G et al. 1999. Multisite reproducibility of results obtained by the broth microdilution method for susceptibility testing of Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, and Mycobacterium fortuitum. J Clin Microbiol. 37:1676-82.

• Biehle J R, Cavalieri S J, Saubolle M A et al. 1995. Evaluation of Etest for susceptibility testing of rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol. 33:1760-4.

• Hoffner S E, Klintz L, Olsson-Liljequist B et al. 1994. Evaluation of Etest for rapid susceptibility testing of Mycobacterium chelonae and M. fortuitum. J Clin Microbiol. 32:1846-9.

• Inderlied CB, Pfyffer GE. Susceptibility test methods: Mycobacteria. ASM Manual, ASM, Washington, 2003, p 1149-1177.

• Van Soolingen D et al. 1993. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 31:1987-95.

• Bauer J et al. 1999. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS 6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark. J Clin Microbiol. 37:2602-6.

Laboratoriediagnostik av tuberkulos och mykobakterios

Allmänt

Referensmetoden för påvisande av mykobakterier inkl M. tuberculosis-komplexet är odling. Det är viktigt att erhålla isolat för resistensbestämning och epidemiologisk typning. Odling av mykobakterier tillhörande M. tuberculosis-komplexet kräver säkerhetslaboratorium med skyddsnivå 3 enligt gällande föreskrifter från Arbetsmiljöverket. På grund av mykobakteriernas långsamma tillväxt rekommenderas mikroskopi och nukleinsyrapåvisning som viktiga komplement för snabbare diagnostik.

Referensmetodik

Odling

Odlingsförfarandet är utformat så att växt av både MTB och icke tuberkulösa mykobakterier (NTM) gynnas.

Referenssubstrat: Löwenstein-Jensen (LJ) äggbaserat fast medium med glycerol eller natriumpyruvat (se Tuberkulos-Bilaga 6). Alternativt kan Middlebrook agar användas men det används traditionellt inte i Sverige för rutindiagnostik. För flytande odling finns kommersiella Middlebrook-buljonger. För optimal känslighet rekommenderas odling på minst ett fast och ett flytande medium.

Homogenisering, dekontamination och koncentrering: Prov som normalt är kontaminerade med normalflorans snabbväxande bakterier (t.ex. sputum) dekontamineras och digereras med NALC-NaOH metoden enligt nedan. Andra vanligt förekommande dekontamineringsmetoder som t. ex Natriumlaurylsulfatmetoden anses ge sämre känslighet.

Enl CLSI:

• NALC och NaOH, Reagens
  • A. 4% NaOH ----- 500 mL
  • B. 2.9 % natriumcitrat dihydrat eller 2.6 % vattenfri natriumcitrat ----- 500 mL
  • C. NALC (tillverka dagligen) ----- 5 g
  • D. pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten)

Blanda A och B, sterilisera och förvara för användning senare. Tillsätt reagens C strax innan användning. Förbrukas inom 24 timmar.

• 1. För över 5-10 mL prov till ett 50 mL centrifugrör.
• 2. Tillsätt motsvarande volym av NALC-NaOH-lösningen
• 3. Skaka röret 5-20 sekunder med Vortex
• 4. Låt stå i 15 min
• 5. Tillsätt steril pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten) till 50 mL-markeringen, skruva åt korken och blanda innehållet genom att vända på röret
• 6. Centrifugera vid 3000 x g i 15 min.
• 7. Häll eller sug omedelbart av supernatanten.
• 8. Resuspendera pelleten i 1-2 mL saltlösning eller fosfatbuffert.
• 9. Blanda försiktigt och inokulera på odlingsmedia och preparatglas. Om inokulering på odlingsmedia försenas resuspendera i 0,2 % BSA fraktion V istället för vatten eller saltlösning.

Om man endast har tillgång till centrifug för 10 mL rör kan en mindre mängd tillsatt prov (1-2 mL) accepteras.

Kontaminerade prov i större mängd (t.ex. urin, ventrikelsköljvätska): Proven bör centrifugeras, helst i 50 mL rör. I vissa fall kan t.ex. 5 x 10 mL rör användas.

Från bottensatsen överförs 1-2 mL till centrifugrör, varefter behandling utförs enligt ovan.

Kroppsvätskor från normalt sterila lokaler; cerebrospinalvätska, benmärg och blod, dekontamineras inte.

Sputum från CF/PCD-patienter, faeces, tarmbiopsier och obduktionsmaterial: tillsätt PANTA, 2 droppar/LJ-rör, före inokulering av provmaterialet.

Vid stora mängder bör centrifugering ske före odling och ev. behandling.

Vävnad, biopsier:

• 1. Provet homogeniseras i steril mortel.
• 2. 1 mL PBS tillsätts.
• 3. Skakas i Vortex.

Blod, benmärg: För ändamålet avsedda buljongflaskor för odling av mykobakterier inokuleras med provmaterial.

Isolering

Provmaterialet kan inokuleras och fördelas dels på fast substrat och dels på flytande. Av provmaterialet inokuleras 0,3-0,5 mL på minst ett LJ-rör. Till röret sätts vid behov (t ex feces eller prover från CF patienter) en lämplig ntibiotikakombination för att undertrycka kontaminerande flora, t.ex. PANTA (Polymyxin, Azlocillin, Nalidixin, Trimetoprim, Amfotericin B) (Becton Dickinson). Inkubation sker under 8 veckor i 37 °C.

Prov från ytliga lokaler (sår, hud) samt prover från t ex CF patienter inokuleras på ytterligare minst ett rör enligt ovan för inkubation i 30 oC. (för växt av t ex M. marinum och M. abscessus).

Prov inkuberas i Middlebrook-buljong för automatisk odling i t ex MGIT-systemet (Becton Dickinson. Prov från ytliga lokaler, leder, skelett och luftvägsprov från CF-patienter kan även inokuleras i ett buljongrör som inkuberas i 30 °C och avläses manuellt.

Cerebrospinalvätska förbehandlas inte utan odlas direkt på LJ-rör samt Middlebrook-buljong.

Blod/benmärg inokuleras helst direkt vid provtagning i blododlingsbuljong avsedd för mykobakterier, upp till 5 mL av provet.

Supplement som tillhandahålls av tillverkaren tillsätts på laboratoriet. Lymfocyter i blodet kan ge ett visst utslag som om växt skulle förekomma i buljongen.

Avläsning

LJ-rör inspekteras minst varje vecka under 8 veckor. Mikroskopipreparat görs från misstänkta kolonier för att konfirmera förekomst av mykobakterier med Ziehl-Neelsen färgning eller Auraminfärgning.

Kolonimorfologin varierar mellan arterna och inom arten beroende på tillväxtbetingelserna från ‘smooth’ till ‘rough’. Kolonierna kan vara opigmenterade (från svagt gulvita) till beige, gula och mera sällan skära till orange. Pigment kan bildas i mörker (skotokromogena) eller endast vid belysning (fotokromogena). Tillväxten är långsam med generationstider 2-20 tim. Synliga kolonier kan observeras efter ca 2-7 dagar (snabbväxare) eller 10 dagar - 8 veckor (långsamväxare). Optimal temperatur för tillväxt varierar från 30 °C (M. marinum) till 45 °C (M. xenopi). De flesta arterna växer på Middlebrook-buljonger eller Löwenstein-Jensen agar, vissa kräver tillsats av t ex järn (t. ex. M. haemophilum, M. genavense) eller mykobaktin (M. avium subart paratuberculosis).

Buljongodlingssystem som MGIT bygger på (automatisk) detektion av mykobakterieväxt. Inkubation under 6 veckor är standard vid primärisolering. Vid växt konfirmeras mykobakterier med mikroskopi enligt ovan, samt odlas ut på LJ substrat.

Identifiering och minimikriterier

Mycobacterium tuberculosis-komplexet

Växt av (oftast) cordbildande syrafasta bakterier på LJ-substrat eller Middlebrook-buljong. Positiv DNA-hybridisering på odlingsisolatet eller tidigare positiv nukleinsyrapåvisning i provet. M. tuberculosis är normalt in vitro resistent mot tiophen-2-carboxylsyrahydrazid (TCH) 5 mg/L och känslig för pyrazinamid, även om avvikelser (TCH =S) eller (PZ = R) förekommer. Även biokemiska tester som nitratreduktion eller niacinproduktion (M. tuberculosis är positiv i båda) förekommer.

M. bovis är alltid TCH-känslig och PZ-resistent.

Konfirmering av M. bovis och M. bovis-BCG bör ske med molekylära metoder t ex spoligotypning (Smittskyddsinstitutet), eller med ett diagnostiskt kit, som med PCR/omvänd hybridisering kan påvisa M tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum I m.fl. (Genotype, Hain Lifescience).

Icke-tuberkulösa mykobakterier, NTM.

Växt av (oftast) icke-cordbildande syrafasta bakterier på LJ eller Middlebrook-substrat. Artbestämning sker främst med diagnostiska kit (PCR/omvänd hybridisering eller 16S sekvensering).

Alternativa diagnostiska metoder

Mikroskopi

Mikroskopisk undersökning av sputum är en snabb, enkel och specifik diagnostisk metod som kan diagnositcera flertalet fall av smittsam lungtuberkulos. Det krävs dock ca 10.000 mykobakterier per mL sputum för positivt resultat, varför mikroskopi inte är tillräckligt känsligt för diagnostik av mykobakterie-förekomst, utan bör alltid kompletteras med odling och eventuellt nukleinsyrapåvisning. Auraminfärgning för fluorescensmikroskopi eller Ziehl-Neelsen färgning för ljusmikrokopi är de vanligaste förekommande metoderna. Färgen kan inte avlägsnas med syra-alkohol, vilket gett upphov till beteckningen ‘syrafasta bakterier’. Syrafastheten kan delvis gå förlorad i vissa faser av tillväxt, och är inte sällan partiell på snabbväxande icke-tuberkulösa mykobakterier.

Vid fluorescensmikroskopi ser man ett större synfält varför avläsningen går snabbare och känsligheten är också något högre. Metoden rekommenderas därför i första hand för undersökning av direktpreparat. Vid ljusmikroskopi efter Ziehl-Neelsen färgning anses man bättre kunna se bakteriernas morfologi, varför metoden har rekommenderats för konfirmering av positiva direktpreparat samt för undersökning av preparat från odlingsisolat. Betydelsen av detta förfarande har sannolikt minskat i takt med introduktionen av molekylära metoder för artidentifiering varför endast fluoroscensmikroskopi torde vara tillräckligt i de flesta fall.

Smittsamhetsbedömning görs med mikroskopi av sputum, och är naturligen av störst intresse före behandling, men kan också ge indikation på återfall om bakterieantalet ökar kraftigt under behandling. Sensitiviteten jämfört med odling är ca 25 % om inte anrikat sputum används och ca 50 % om sputum förbehandlas och centrifugeras. Specificiteten är vanligen > 99 %.

Man kan inte med mikroskopi differentiera mellan M. tuberculosis-komplexet och NTM. Nukleinsyrapåvisning bör utföras för MTB vid fynd av syrafasta bakterier i luftvägssekret för att klarlägga om det rör sig om TB eller NTM.

OBS att risken för kontamination av provet med ovidkommande mykobakterier bör beaktas. Källor för kontamination kan vara t.ex. kranvatten, (M. gordonae m.fl.), färgvätskor och immersionsolja.

• Homogenisering av prov: Prov bör homogeniseras och koncentreras med centrifugering >3000 x g för att öka sensitiviteten av mikroskopi och odling. Viskösa prov görs flytande genom förbehandling (se ovan under primärisolering).

• CLSI: Utstryk och fixering: Utstryk prepareras på vanligt sätt och fixeras genom upphettning med gaslåga tre gånger eller i 65 - 75 °C i minst 2 timmar på en elektrisk preparatvärmare. Fluorescensfärgning med auramin: Fixerade preparat exponeras för auraminlösning 15 min. Skölj med vatten. Avfärga med syra-alkohollösning 2 min. Skölj med vatten. Kontrastfärga med kaliumpermanganat i 2 minuter. Skölj och lufttorka. Färgning i kyvett rekommenderas inte eftersom det finns en dokumenterad risk för korskontaminering mellan prover. Om det av praktiska skäl inte kan undvikas bör kyvetterna rengöras noga och preparat från primärprover och odlingsisolat får inte färgas i samma kyvett. Kontaminationsrisken bör beaktas vid avläsning.

Reagens, se Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept.

Auramin står på Arbetsmiljöverkets lista över carcinogena ämne varför speciella åtgärder krävs för att hantera och omhänderta ämnet. V g se [1]

Avläsning

Screening av preparat kan ske vid lägst 250 × förstoring (objektiv 20× eller 40×, okular 10-12,5×). Blåljus från 100W Hg-lampa med filterkombination för auramin eller LED illuminator kan användas. Granska minst 30 synfält. Använd större förstoring för att identifiera misstänkta mykobakterier (”beading” i MTB, se t.ex. ASM-manual). Rekommendation att positiva preparat bedöms av ytterligare en avläsare alternativt att färgning med Ziehl-Neelsen görs.

Kvalitetskontroll

En standardiserad preparatkontroll inkluderas vid varje färgningstillfälle. M. gordonae eller annan apatogen mykobakterieart rekommenderas som positiv kontroll och t ex E. coli som negativ.

Molekylärbiologiskt påvisande

Direktpåvisning av M. tuberculosis-komplexet med polymeraskedjereaktionen, PCR, eller liknande molekylärbiologiska metoder, är viktiga snabbdiagnostiska metoder, speciellt vid lungtuberkulos. Sålunda visades redan 1993 med PCR sensitivitet 83 % och specificitet 99 % gentemot odling för luftvägsprov. Samma metoder kan användas för serösa sekret och även vävnadsprov. Särskilt i de senare är bakteriemängden ofta låg och inhibitorer kan störa reaktionen, varför sensitiviteten är lägre. Eftersom bakterier som är döda kan påvisas med PCR kan odlingsnegativa prov vara sant PCR-positiva. Stabiliteten hos DNA möjliggör detektion av DNA från M. tuberculosis komplex i formaliniserade prov och även i t.ex. luftvägsprov efter insatt tuberkulosbehandling.

Sensitiviteten för mikroskopipositiva prov är ca 95-100 % (ca 80 % för alla luftvägsprov) jämfört med odling. För mikroskopinegativa luftvägsprov är sensitiviteten ca 60 % jämfört med odling och för mikroskopinegativa prov från vävnad, sekret och exkret 50-60 %. Specificiteten är 99-100 %. Negativ PCR utesluter således inte tbc! Inhibitorer i sekret och vävnader kan minska sensitiviteten i PCR. Sköljning av materialet med PBS kan avlägsna inhiberande substanser (detta behövs ej för NALC-NaOH förbehandling). Även i likvor finns inhibitorer varför spädning och centrifugering bör ske men hellre bör andra DNA-preparationsmetoder rekommenderas.

PCR-tekniken är krävande trots att utmärkta kits finns på marknaden. Strikta rutiner behövs för att hindra kontamination av laboratoriet med amplifierat material. PCR bör endast utföras i laboratorier som har resurser för samtidig mykobakterieodling, så att kontinuerlig jämförelse av resultaten kan ske. Slutlig bakteriologisk diagnostik med differentiering inom M. tuberculosis-komplexet kan för närvarande inte ske utan odling. Resistensbestämning sker heller vanligen inte utan odling.

Resistensbestämning av MTB-komplexet

Stammar av MTB som inte utsatts för tb-läkemedel är känsliga för dessa. Dock föreligger en spontan mutationsfrekvens på $10^{-}$$^{7}$- $10^{-}$$^{8}$, för olika läkemedel. Resistensutveckling i bakteriologisk mening uppkommer genom selektionstryck vid inadekvat terapi, varvid den resistenta mutanten snabbt kommer att dominera. Samlad klinisk erfarenhet av tbc-behandling har visat att denna blir effektiv om frekvensen resistenta mutanter i bakteriepopulationen understiger 1 % för vart och ett av de ingående medlen. För praktiskt bruk tillämpas därför gränsen 1 % vid in vitro resistensbestämning för tuberkulostatika. Följande medel är förstahandsval: isoniazid, etambutol, rifampicin och pyrazinamid. Resistensbestämning mot andra- och tredjehandspreparat liksom MIC-utförs, när så önskas, vid referenslaboratoriet vid Smittskyddsinstitutet.

För att snabbt erhålla ett preliminärt resultat för rifampicin- och isoniazidresistens gällande M. tuberculosis-komplexet kan molekylärbiologisk påvisning utföras med kommersiellt kit (t ex HAIN). Känsligheten att detektera INH-resistens är ca 90 % och för rifampicin 95-98 %. Resultaten ska dock konfirmeras vid positiv odling i samband med sedvanlig resistensbestämning.

MGIT

Resistensbestämning av M. tuberculosis-isolat mot isoniazid (INH), rifampicin samt etambutol kan utföras i flytande medium, MGIT-rör, med fluorescensindikator. BACTEC MGIT 960 SIRE Kit är ett kvalitativt test som tar 4-13 dygn. BACTEC MGIT 960 PZA kit för resistensbestämning mot pyrazinamid (PZA) tar 4-21 dygn. Testen bygger på jämförelse av M. tuberculosis-isolatets tillväxt med och utan antibiotika. Kolonier utvuxna på fast substrat eller växt i MGIT-rör kan användas som inokulat. Instrumentet indikerar att resistensbestämningen är klar att tolkas när signifikant växt är uppmätt i äxtkontrollen (inom tillåten tidsrymd, t ex 4-13 dygn).

Följande testkoncentrationer används i MGIT-rören

• Preparat | Koncentration
• Isoniazid 0,1 mg/L
• Isoniazid 0,4 mg/L
• Rifampicin 1 mg/L
• Etambutol 5 mg/L
• Pyrazinamid 100 mg/L
• Amikacin 1 mg/L
• Kapreomycin 2,5 mg/L
• Etionamid 5 mg/L
• Kanamycin 4 mg/L
• Linezolid 1 mg/L
• Moxifloxacin 0,25 mg/L
• Ofloxacin 2 mg/L
• Rifabutin 1 mg/L
• Streptomycin 1 mg/L

För isoniazid utförs vid behov MIC – bestämning (0.5 – 16 mg/L)

Cykloserin och PAS testas inte i MGIT systemet utan på LJ-medium med den s k proportionsmetoden. Brytpunktskoncentrationen är 40 resp 1 mg/L för dessa preparat. Stammar resistenta mot INH och rifampicin (MDR-TB) skickas till referenslaboratorium, Smittskyddsinstitutet, för verifiering av resistens samt utvidgad resistensbestämning mot de ovan listade preparaten.

[redigera] Resistensbestämning av NTM 

Resistensbestämning av NTM utförs i regel inte eftersom den kliniska relevansen av ett NTM fynd ofta är oklar och att det för flertalet arter och antibiotika inte finns någon dokumenterad korrelation mellan in vitro MIC och klinisk effekt. I följande fall kan dock resistensbestämning övervägas: • Vid infektion med M. avium-komplexet som står på behandling med klaritromycin (alternativt azitromycin) som sviktar på behandling alternativt vid profylax genombrott hos HIV patient. I dessa fall bör MIC bestämning mot klaritromycin utföras. • Vid planerad behandling av infektion med vanliga snabbväxande mykobakterier som t ex M. abscessu, M. chelonae eller M. fortuitum-komplexet. • För långsamväxande NTM finns inte någon enskild metod för resistensbestämning som rekommenderas generellt. För MAC rekommenderar CLSI en buljongbaserad metod som t ex BACTEC 460 (systemet är dock på väg att utfasas under 2010) eller mikrotiterspädning. För övriga långsamväxande NTM kan både fast och flytande medium användas men måste valideras och kvalitetssäkras för varje metod och species. För snabbväxande NTM rekommenderar CLSI MIC-bestämning med mikrotiterspädning. Agartest inklusive E-test rekommenderas ej. Beträffande rekommenderade medel för resistensbestämning för respektive art hänvisas till Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B, et al. An official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases, American Thoracis Society Documents. Am J Respir Crit Care Med. 2007;Vol 175: 367-416 För icke-tuberkulösa mykobakterier är det önskvärt om möjligt att alla arter som resistensbestäms åtföljs av en ATCC-stam av samma art. Då det rör sig om få isolat är det lämpligt att ev resistensbestämning utförs på laboratorier med erfarenhet av resistensbestämning av NTM.

[redigera] Epidemiologisk typning Molekylärepidemiologisk typning av M. tuberculosis-komplexet sker för att kartlägga smittkedjor och uppkomna kluster av tuberkulosfall. För detta sänds väl utvuxna förstagångsisolat från varje patient på fast substrat till Smittskyddsinstitutet. Isolat erhållna vid behandlingssvikt, recidiv eller befarad reinfektion bör också undersökas. Förutom patientens ID, provtagningsdatum, och provets ID, bör även provmaterial, resultat av mikroskopi och resistensbestämning meddelas, enklast genom att skicka med en kopia av laboratoriets slutsvar. För närvarande utgör RFLP (restriktions-fragment-längd-polymorfism) referensmetodik för molekylärepidemiologisk typning, men alternativa PCR-baserade typningsmetoder (främst spoligotypning och MIRU-VNTR) utvärderas som komplement till eller ersättning av RFLP. Resultaten av RFLP för ett isolat redovisas som graden av identitet (ID) med den befintliga RFLP-databasen eller med ett givet prov: • 100 % ID: stammarna tillhör ett kluster, epidemiologiskt samband är sannolikt. • >90 % ID: epidemiologiskt samband kan inte uteslutas. • <90 % ID: unikt mönster, inget epidemiologiskt samband. Vid förekomst av < 5 band i RFLP kompletteras undersökningen med spoligotypning. Vid identiskt spoligotypningsmönster anses stammarna tillhör ett kluster. Information om RFLP-resultat meddelas till: • Insändande laboratorium, • SMI epidemiologiska enheten, som meddelar • vederbörande smittskyddsläkare, • som kontaktar vederbörande kliniker i fall av klusterbildning. Om flera smittskyddsläkare involveras samordnar Statsepidemiologen utredningen.

[redigera] Kvalitetskontroll 

• Referensstammar enl CLSI för kvalitetskontroll av odlingsmedium: o M. tuberculosis ATCC 25177 o M. kansasii ATCC 12478 o M. fortuitum ATCC 6841

BCG, stam Copenhagen, BCG-vaccin, Statens Serum Institut, se FASS. [redigera] Svarsrutiner [redigera] Mikroskopi Provet rapporteras som positivt i mikroskopi om syrafasta bakterier påträffas i preparatet. Antalet bakterier kan vara ett grovt mått på effekten av behandling, men utsöndringen är intermittent. Därför är detaljerad kvantifiering vansklig och förutsätter höggradig standardisering.

Förslag till svarsalternativ som dock kan justeras beroende på metod som används: 1-9 stavar/preparat : Ange antalet stavar (gäller andra prov än luftvägsprover, bedöm med försiktighet t ex 2 syrafasta stavar, osäkert fynd nytt prov kan rekommenderas) 10-20 stavar/preparat 1+: Sparsamt med syrafasta stavar >10 stavar/synfält 3+: Rikligt med syrafasta stavar Vid negativt utfall: <10 stavar/preparat (minst 30 synfält): Inga syrafasta stavar (gäller luftvägsprov)

[redigera] Nukleinsyrapåvisning/odling/resistensberstämning Förslag till svarsalternativ Nukleinsyrapåvisning Positiva prov svaras: M. tuberculosis-komplexet DNA PÅVISAT. Odling pågår, svar inom 6 veckor Negativa prov svaras: Odling pågår, svar inom 6 veckor M. tuberculosis-komplexet DNA EJ påvisat. Prov som innehåller inhibitorer svaras: Odling pågår, svar inom 6 veckor Resultatet av DNA-analysen kan inte tolkas p.g.a inhiberande substanser i provmaterialet.

Fynd av syrafasta stavar med för mykobakterier typiskt koloniutseende svaras: Positiva odlingar Svara vid positivt mikroskoperingsresultat från isolat: +C (och isolat med positivt resultat i PCR eller omvänd hybridisering): Växt av: M. tuberculosis-komplextet , art- och resistensbestämning pågår. Om resistensbestämning utförts med molekylärbiologisk metod: M. tuberculosis-komplexet, art- och resistensbestämning pågår. INH = känslig (alt resistent), rifampicin=känslig (alt resistent). Resistensbestämning utförd med molekylärbiologisk metod. Känsligheten att detektera INH-resistens är 90% och för rifampicin 95%. Resistensbestämning konfirmeras när odlingen är positiv. +0C och +: Växt av: MYKOBAKTERIER, artbestämning pågår (Alternativt avvakta artbestämning innan svar.) Svara stegvis allteftersom artbestämning och resistensbestämning är klara.

Uppmana remitterande läkare att rapportera nya fall till smittskyddsläkare . Alla M. tuberculosis-komplex isolat och alla isolat med icke-tuberkulösa mykobakterier rapporteras via SMI-net av respektive laboratorium. Klinisk rapportering sker endast för M-tuberkulosis-komplexet.

Negativ odling svaras: Ingen växt av mykobakterier. redigera] Laboratorierapportering Infektion med M. tuberculosis regleras av smittskyddslagen - Allmänfarliga sjukdomar och infektion med Mycobacterium species av smittskyddslagen - övriga anmälningspliktiga sjukdomar.

[redigera] REFERENSER ny lista under utarbetande • Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), Laboratory Detection and Identification of Mycobacteria; Approved Guideline, CLSI document M48-A (ISBN 1-56238-669-7) Wayne PA: CLSI; 2008 • • Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B, et al. An official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases, American Thoracis Society Documents. Am J Respir Crit Care Med. 2007;Vol 175: 367-416 • • Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Molecular Diagnostic Methods for Infectious Disease; Approved Guideline – Second Edition. CLSI document MM3-A2. Wayne PA:CLSI; 2006. • • Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)/NCCLS, Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. CLSI/NCCLS document M24-A. Wayne PA: NCCLS;2003 • Huard R C, de Oliviera Lazzarina L C, Butler W R, van Soolingen D, Ho L H. 2003. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions. J Clin Microbiol. 41:1637. • Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutierrez C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS, Samper S, van Soolingen D, Cole ST. 2002. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 3684-9. • DeBoer A S, Blommerde B, de Haas P E W, Sebek MMGG, et al. 2002. False-positive Mycobacterium tuberculosis cultures in 44 laboratories in the Netherlands (1993-2000): Incidence, risk factors, and consequences. J Clin Microbiol. 40: 4004-9. • Canetti G, Froman S, Grosset J et al. 1963. Mycobacteria:laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull WHO. 29: 565-78. • Inderlied C. Antimycobacterial agents: In vitro susceptibility testing, spectrums of activity, mechanisms of action and resistance, and assay for activity in biological fluids. In: Antibiotics and Laboratory Medicine, V Lorian Ed. Williams & Wilkins 1996. • Woods G L, Bergmann J S, Witebsky F G et al. 1999. Multisite reproducibility of results obtained by the broth microdilution method for susceptibility testing of Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, and Mycobacterium fortuitum. J Clin Microbiol. 37:1676-82. • Inderlied CB, Pfyffer GE. Susceptibility test methods: Mycobacteria. ASM Manual, ASM, Washington, 2003, p 1149-1177. • Van Soolingen D et al. 1993. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 31:1987-95. • Bauer J et al. 1999. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS 6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark. J Clin Microbiol. 37:2602-6. Hämtad från "http://smikiwiki.smi.se/referensmetodik/Tuberkulos_och_mykobakterios-laboratoriediagnostik" Kategori: Laboratoriediagnostik-Nedre luftvägsinfektioner Visningar • Sida • Diskussion • Redigera • Historik • Flytta • Bevaka Personliga verktyg • Anita Svahn • Min diskussion • Mina inställningar • Min bevakningslista • Mina bidrag • Logga ut Navigering • Huvudsida • Deltagarportalen • Aktuella händelser • Senaste ändringarna • Slumpsida • Hjälp Sök

Verktygslåda • Vad som länkar hit • Relaterade ändringar • Ladda upp fil • Specialsidor • Utskriftsvänlig version • Permanent länk • PDF-version Skapa en bok • Lägg till sida till bok • Hjälp för böcker

• Sidan ändrades senast den 13 december 2009 kl. 14.50. • Denna sidan har visats 96 gånger. • Integritetspolicy • Om Referensmetodik för laboratoriediagnostik • Förbehåll