Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker
Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
och
falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)
Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker
Bakgrund
Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott med MRSA, framförallt med de vanligaste spa-typerna, är komplettering med PFGE ofta användbar.
För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Internationellt accepterade metoder för PFGE som tillåter jämförelser av bakterieisolat i olika länder finns bara för ett fåtal bakteriearter, däribland MRSA.
Nedan beskrivs en metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.
Indikation
För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra olika isolat av MRSA.
Provmaterial
Renkultur av Staphylococcus aureus på agarplatta.
Analysprincip
PFGE baserar sig på att med restriktionsenzymer klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten genom elektrofores i en agarosgel. Det är helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt restriktionsenzym.
Efter avslutad elektrofores färgas gelen för att visualisera banden av DNA-fragment som separerats efter storlek (ett PFGE-mönster) och fotograferas. Resultatet databehandlas för att identifiera likheter och olikheter avseende bandens läge hos de olika isolaten. Bakterieisolat oskiljaktiga PFGE-mönster ges därmed samma beteckning.
Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens
- För analysen behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
- Referensstam S. aureus NCTC 8325
- Gjutformar till agarospluggar
- Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
- TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
- Ultra pure TM agarose Invitrogen
- Restriktionsenzym Sma1 med buffert
- Gel Red
Analyspocedur
- DNA-extraktion: Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (cirka 10 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenderas bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.
Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.
- Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma1
- 1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
- 2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
- 3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
- 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
- 5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
- 6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
- Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
- 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
- 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
- 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
- 4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
- 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
- 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
- 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
- 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Gelbilden analyseras.
Analys av bandmönster
Isolatens bandmönster jämförs och grad av genetisk likhet analyseras för att styrka/utesluta möjliga epidemiologiska samband.
Om bandmönstren inte går att särskilja eller avviker i <3 bandpositioner, bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung. Skiljer bandmönstren i >3 men <7 positioner bedöms bakterieisolaten som möjligen tillhörande ett utbrott eller ha ett gemensamt ursprung. Om bandmönstren skiljer i >7 band, vilket oftast innebär att cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa.
Observera att det inte finns några absoluta gränser för avvikelsernas antal enligt ovan, och slutbedömningen bör helst vägas mot övriga epidemiologiska data.
REFERENSER
- 1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
- 2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed Field Gel Electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995; 33:2233-2239