ÖLI-bilaga 16
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Övre luftvägsinfektioner (ÖLI)
Metod
1. Cellodling
Cellinsådd: 50 000 celler/mL medium.
Odlingsbetingelser: 37°C, CO2 ej nödvändigt annat än vid uppodling av frusna celler. Odlingsflaskorna förvaras stående, eftersom cellerna växer fritt i mediet.
Skötsel: Cellerna delas 1/2 en gång/vecka. Häll bort så mycket medium som möjligt, varefter flaskan skakas, och hälften av det kvarvarande mediet med celler hälls av (dessa celler kan odlas vidare för att fördubbla cellmängden eller användas för preparatframställning). Tre dagar senare görs mediumbyte. Ca 3/4 av mediet hälls försiktigt av och ersätts med nytt.
Nedfrysning av celler
I kryorör sätts ca 2x celler/ml RPMI med 20 % inaktiverat fetalt kalvserum och 10 % DMS0. Nedfryses långsamt enligt laboratoriets metod för frysning av celler (speciell cellfrys är att föredra, annars exempelvis frigolitbox i -70°C över natt eller från -20°C till halsen på kväveklockan över natt). Cellerna slutförvaras i flytande kväve.
Upptagning av nedfrusna celler: Kryorören tinas i rumstempererat vatten. Innehållet överförs till 25 cm plastflaskor med 15 ml medium. Odlas i CO2.
Efter 24 timmar sugs det gamla mediet försiktigt av, och ersätts med nytt. När mediet gulnat (brukar ta ca 4 dagar) sker delning och skötsel enligt tidigare angivna metoder.
Preparatframställning
P3FIR1 (för detektion av antikroppar mot lytiska antigener): Cellkulturen används 1 vecka efter delning. Medium med uppslammade celler centrifugeras (400g, 10 min), därefter ytterligare 2 ggr efter uppslamning i PBS. Cellerna räknas och slammas upp i PBS i en koncentration av /ml. Cellerna droppas på rena objektglas (helst maskade) 20-30 μl/prep. Får lufttorka, och fixeras därefter i vattenfri, iskall aceton (5 min). Preparaten förvaras vid 4°C och kan användas under 1 vecka.
NC37 (för framställning av EBNA-preparat): Cellkultur används 2 dagar efter delning. Häll bort 4/5 av mediet, centrifugera medium och celler 10 min, 400g. Häll bort supernatanten, slamma i 5 ml PBS. 5 ml cellsuspension sätts till ett rör med 2 ml Ficoll. Centrifugeras (400g, 20 min). Cellbandet sugs av och sköljs x 2 genom uppslamning i PBS och centrifugering. Cellema räknas i vitalfärgning. Minst 80 % ska vara levande för preparatframställning Slamma cellerna i PBS, 5 milj/mL. Centrifugera och sug bottensatsen torr. Tillsätt 200 μl hypotonlösning. Slamma upp cellerna och droppa på objektglas. 5-10 μl/prep. Lufttorka, fixera i vattenfri aceton/metanol 2/1. Förvaras vid 70°C.